使用溶酶体酸性脂肪酶来治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶缺乏的制作方法
【专利说明】使用溶酶体酸性脂肪酶来治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶缺乏
[00011本申请是申请日为2011年9月9日、申请号为201180053951.X、发明名称为"使用溶 酶体酸性脂肪酶来治疗患者的溶酶体酸性脂肪酶缺乏"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003]溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏是罕见的溶酶体贮积病(LSD)，其特征为由于酶的缺 乏而无法降解溶酶体中的胆固醇酯(CE)和甘油三酯(TAG) 1AL缺乏与其它溶酶体贮积病的 类似之处在于底物在许多组织和细胞类型中积聚。在LAL缺乏中，底物积聚在网状内皮系统 的细胞中是最明显的，包括肝脏中的Kupffer细胞、脾脏中的组织细胞、以及小肠中的固有 层。网状内皮细胞表达巨噬细胞甘露糖/N-乙酰基葡糖胺受体(也称为巨噬细胞甘露糖受 体、MMR或CD206)，所述受体介导结合、细胞摄取以及具有GlcNAc或甘露糖封端的N-聚糖的 蛋白质的溶酶体内化，并且提供用于在这些关键细胞类型中潜在校正酶缺乏的途径。
[0004]LAL缺乏是多系统疾病，其最常见表现为胃肠、肝脏以及心血管并发症，并且造成 明显的发病率和死亡率。LAL缺乏的临床作用是由于脂质材料在多种组织的溶酶体中大量 积聚和对胆固醇和脂质稳态机制的强烈干扰，包括肝脏胆固醇合成的实质性增加。LAL缺乏 呈现为至少两种表型:沃尔曼氏病(WolmanDisease，WD)和胆固醇酯积病(CESD)。
[0005]沃尔曼氏病，以首先描述它的医生来命名，是LAL缺乏的最具有侵袭性的呈现。这 个表型的特征为胃肠和肝脏表现，包括生长不足、吸收不良、皮脂溢、体重剧烈减轻、淋巴结 病、脾肿大以及肝肿大。沃尔曼氏病通常在生命期的第1年内快速进行并且常常是致命的。 病例报告评论表明由于在生命期的第1年内的严重LAL缺乏，存活超过12个月龄对于呈现出 生长不足的患者是极其罕见的。在所述最具侵袭性的形式中，生长不足是主要临床特征，并 且是早期死亡率的主要原因。由肝脏增大和转氨酶升高所证明的肝损害的情况在婴儿中也 是常见的。
[0006]沃尔曼氏病的诊断通过身体发现和实验室分析来确定。婴儿通常由于腹泻、持续 性呕吐、喂养困难、发育迟缓以及发育停滞而在生命期的前两二个月内住院。身体发现包括 因肝肿大和脾肿大而腹胀，并且放射检查经常揭示肾上腺的钙化。实验室评估通常揭示血 清转氨酶水平升高，和内源性LAL酶活性不存在或者显著降低。在一些患者中观察到胆固醇 和甘油三酯的血液水平升高。
[0007]患有LAL缺乏的患者还可以在生命后期呈现出主要的肝脏和心血管损害，并且这 经常称为胆固醇酯贮积病(CESD)。在CESD中，肝脏受到明显的肝肿大、肝细胞坏死、转氨酶 升高、肝硬化以及肝纤维化的严重影响。由于CE和TAG的水平提高，因此心血管损害可以高 脂血症为特征。在一些患有CESD的受试者中已经报导了脂肪沉积物积聚在动脉壁上(动脉 粥样硬化）。这些沉积物使动脉管腔变窄，并且可以导致血管堵塞，从而增加包括心肌梗塞 和中风在内的明显的心血管事件的风险。然而，并非所有患有LAL缺乏的受试者都发展出动 脉粥样硬化。例如，沃尔曼氏病患者承受着与下列疾病有关的其它症状，包括:肝脏和脾脏 增大、淋巴结病、以及小肠吸收障碍，但是WD通常不以动脉粥样硬化为特征(TheMetabolic andMolecularBasesofInheritedDisease(Scriver，C.R.，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.与 ValleD.编著）第7版，第2卷，第2570页McGraw-Hi11，1995)。同样，并非所有CESD患者都展 现出动脉粥样硬化。参见Di Bisceglie等，Hepatology 11:764-772( 1990) ;Ameis等，J. Lipid Res. 36:241-250(1995) <XESD的呈现对于一些未诊断出的患者高度可变，直到成 年后期表现出并发症，而其它人可以在儿童早期呈现出肝功能障碍。CESD与寿命缩短和明 显的不健康相关。患有CESD的那些人的预期寿命取决于相关并发症的严重性。
[0008]沃尔曼氏病的现有治疗选择非常有限。将抗体施用至发热和/或有感染迹象的婴 儿。可以开出类固醇替代疗法用于肾上腺机能不全和专门的营养支持，并且在没有这些介 入会预防死亡的证据的同时，目前也不清楚它们是否对短期存活具有影响。在用骨髓移植 治疗的四名患有LAL缺乏的一系列患者中，由于移植数月内所述程序的并发症，所有四名患 者都死亡。尽管在后续病例报导中描述了一些成功的情况，但是死亡率保持较高，并且多名 患者由于他们病情太重而无法从移植前调节性方案中存活，因此没有被移植。极少数的报 导的长期存活者确实表明造血细胞中的酶缺乏的校正单独就足以实质性改善这种疾病的 临床状况。通常通过饮食限制来提供临床支持以尝试限制与导致死亡的疾病的急性表现相 关的不可转运的和不可分解代谢的脂质的积累。
[0009]CESD表型的现有治疗选择集中于经由控制脂质积聚(通过排除富含胆固醇和甘油 三酯的食物的饮食）并且通过施用降胆固醇药物（例如，斯达汀（statin)和消胆胺 (cholestyramine))抑制胆固醇合成和载脂蛋白B的产生来对症治疗。尽管可以看到一些临 床改善，但是潜在的疾病表现持续存在并且仍存在疾病进展。
[0010]已经表明，用重组LAL的酶替代疗法可以是溶酶体酸性脂肪酶缺乏和相关病症的 可行治疗选择（参见Meyers等·（1985)NutritionRes· 5(4) :423-442 ;W09811206;以及 Besley(1984)ClinicalGenetics26:195-203)。使用LAL缺乏的小鼠模型的一些研究已经 证实通过每3天一次输注高剂量的(超过1毫克/公斤体重)重组人LAL，LAL缺乏(LAI/a)小鼠 的一些异常得以校正（例如参见GrabowskiUS2007/0264249)。这些校正LAL缺乏小鼠内的 缺陷的早期研究表明为了校正潜在的表型，需要相对大量和高频率剂量的重组LAL蛋白。还 重要的是应注意，不同于最初描述的LAL+大鼠模型（Yoshida和Kuriyama( 1990 ) LaboratoryAnimalScience，第40卷，第486-489页），上述研究中使用的LAL-Z-小鼠模型并 不酷似人WD，因为LAL缺乏小鼠并未展现出人患者中观察到的生长缺陷。
[0011]迄今为止，没有外源性LAL施用至人，并且没有有效的疗法可用于治疗LAL缺乏，包 括WD、CESD以及其它疾病。因此，为了改善患者的生活品质，极端需要具有最低施用频率的 疗法。另外，需要在人患者中恢复生长、使肝功能正常化、增加LAL组织浓度并且增加LAL活 性的治疗有效剂量。
[0012] 发明概述
[0013]本发明是基于首次人临床病例，其中患者被成功地给予外源性LAL。患有LAL缺乏 的其它致命形式(沃尔曼氏病或早发性LAL缺乏)的婴儿通过施用外源性LAL得到有效治疗， 并且对患有迟发性LAL缺乏的一组人患者评估了LAL酶替代疗法的安全性评价。患有早发性 LAL缺乏的婴儿每周以低剂量施用，而没有引发任何不良事件或反应。早在初始施用后1至2 周就观察到生命体征和临床/实验室测量的功效的显著改善。在每周给药4个月之后，治疗 的婴儿已经恢复正常生长并且展现出与LAL缺乏有关的所有症状(包括吸收障碍、肝肿大以 及肝功能）的明显改善。迟发性成年患者也每周给予低量的外源性LAL，没有不良事件的迹 象。因此，迄今为止收集的临床数据显示使用本发明的外源性LAL的酶替代疗法提供用于 LAL缺乏的安全且有效的治疗。
[0014] 因此，本发明提供通过施用有效量的外源性溶酶体酸性脂肪酶(LAL)来治疗人患 者中与LAL缺乏相关的疾病或病症的方法。外源性LAL可以为具有N-连接型聚糖结构的重组 人LAL，所述聚糖结构包含至少一个甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸。外源性LAL被有效地内化 到例如淋巴细胞、巨噬细胞和/或成纤维细胞的溶酶体中。
[0015]在一些实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被诊断为患有沃尔曼氏病(WD)。在一个 实施方案中，施用足以提高WD患者的生长。在一个实施方案中，施用足以恢复WD患者的正常 生长。在其它实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被诊断为患有胆固醇酯贮积病(CESD)。根 据本发明的治疗方法可以提供给任何年龄的人患者。
[0016] 本文还提供通过将有效改善肝功能的量的重组人LAL施用至患者来治疗患有LAL 缺乏的人患者的方法。在一些实施方案中，施用足以使肝脏检验正常化。在一个实施方案 中，施用足以降低肝脏转氨酶的血清水平。例如，肝脏转氨酶可以包括血清天冬氨酸转氨酶 (AST)和/或丙氨酸转氨酶(ALT)。在一个实施方案中，施用足以使肝肿大减至最小。在一个 实施方案中，施用足以降低患者的肝脏大小。在一个实施方案中，施用足以降低血清铁蛋白 水平。
[0017] 在一个实施方案中，施用足以降低血清脂质水平，包括例如胆固醇酯(CE)和/或甘 油三酯（TG)水平。
[0018] 还提供增加患有LAL缺乏的人患者的LAL活性的方法。所述方法包括将重组人LAL 施用至患者，以便所述施用使得LAL活性增加，如可在例如淋巴细胞和/或成纤维细胞中所 测量。
[0019] 在一个实施方案中，描述通过每5天1次至每30天1次将有效量的外源性LAL蛋白施 用至患者而治疗人患者的与LAL缺乏相关的病状的方法。
[0020] 在一些实施方案中，患有LAL缺乏的人患者被给予约0.lmg至约50mg外源性LAL/公 斤体重。在一个实施方案中，人患者被给予约0.lmg至约10mg的外源性LAL/公斤体重。在一 个实施方案中，人患者被给予约〇.lmg至约5mg的外源性LAL/公斤体重。
[0021 ] 在一个实施方案中，输注速率在约0.lmg/kg/h至约4mg/kg/h之间。
[0022] 在一些实施方案中，人患者用第二治疗剂治疗。第二治疗剂可以包括例如降胆固 醇药物（例如，斯达汀或依泽替米贝（ezetimibe))、抗组胺剂（例如，苯海拉明 (diphenhydramine))或免疫抑制剂。
[0023] 附图简述
[0024]图1A描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量:0.2mg/kg(初始输注，第0周）； 0.3mg/kg(第1周）；0.5mg/kg(第2周）；以及1 .Omg/kg(第3-8周））的婴儿男性沃尔曼氏病 (即，早发性LAL缺乏）患者的血清天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。图1B描绘同一患者的血清 丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。患者在初始输注时的年龄为4个月零1周。
[0025]图2描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量:0.2mg/kg(初始输注，第0周）；0.3mg/kg(第1周）；0.5mg/kg(第2周）；以及1 .Omg/kg(第3-8周））的沃尔曼氏病患者的血清 铁蛋白水平。患者在初始输注时的年龄为4个月零1周。示出第0周初始给药后1周以后的血 清铁蛋白水平。
[0026]图3描绘每周接受外源性LAL(SBC-102)给药(剂量:0.2mg/kg(初始输注;第0周）； 0.3mg/kg(第1周）；0.5mg/kg(第2周）；以及1 .Omg/kg(第3-8周））的沃尔曼氏病患者的生长 速度。
[0027]图4描绘沃尔曼氏病患者的生长曲线(男孩的年龄标准体重(kg)百分位数）。
[0028]图5描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清AST水平。
[0029]图6描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清ALT水平。
[0030]图7描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清 白蛋白水平。
[0031]图8描绘每周接受0.35mg/kg的剂量的外源性LAL的41岁白人男性CESD患者的血清 铁蛋白水平。
[0032] 图9图解了四只年龄匹配的雄性大鼠的增重速率，这四只大鼠各自被分配给下列 四种外源性LAL给药方案中的一种:每周一次lmg/公斤、每周一次5mg/公斤、每2周一次5mg/ 公斤或安慰剂。柱内的数字表示出生后的天数。
[0033] 图10描绘野生型对照、外源性LAL治疗的LAL缺乏大鼠以及安慰剂治疗的LAL缺乏 大鼠的病理学和组织病理学检查的结果。宏观病理学证实用外源性LAL治疗的大鼠的肝脏 的颜色和大小正常化。来自用外源性LAL治疗的大鼠的肝脏组织的组织病理学显示基本上 正常的肝脏组织学，这与安慰剂治疗的动物中的泡沫状巨噬细胞的大量积聚形成明显对 照。
[0034] 图11描绘在使用顺序扫描模式通过共聚焦荧光显微术检查的细胞的溶酶体中，重 组人LAL( SBC-102)和溶酶体标记物的共定位。
[0035]图12描绘使用巨噬细胞细胞系NR8383通过竞争结合测定评价的重组人LAL(SBC-102)与GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性。
[0036]图13描绘重组人LAL在正常细胞和LAL-缺乏细胞中的活体外活性。
[0037]图14图解了重组人LAL(SBC-102)治疗对LAL缺乏大鼠的内部器官质量的作用。器 官大小表示为在每周施用媒介物或5mg/kg的SBC-102持续4周之后，在LAL+大鼠和LALV+大 鼠中在8周龄测定的体重百分率。
[0038]图15图解了在每周给予媒介物或5mg·kg"1的SBC-102持续4周之后，野生型和LAL缺乏大鼠的体重。剂量施用在第4周开始以菱形在X-轴上突出显示。
[0039]图16描绘在每周给予媒介物或5mg·kg<的SBC-102持续4周之后，在WT和LAL缺乏 大鼠中在8周龄测定的肝脏胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯的水平。
[0040] 图17描绘LAL缺乏大鼠的体重增加百分率。
[0041]图18描绘在施用SBC-102持续4周之后，LAL缺乏大鼠的肝脏重量(作为体重的百分 率)。
[0042]图19图解了在施用SBC-102持续4周后，LAL缺乏大鼠中的组织胆固醇酯的水平。 [0043]发明详述
[0044]本发明提供用于治疗患有对施用外源性溶酶体酸性脂肪酶具有反应性的疾病或 病症的人的方法。
[0045] 定义
[0046]为了方便起见，说明书、实施例以及所附权利要求书中使用的某些术语在本文中 进行阐述以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
[0047]如本文使用的"LAL"是指"溶酶体酸性脂肪酶"并且贯穿本说明书这两个术语可互 换使用。LAL可以是人蛋白，S卩，人溶酶体酸性脂肪酶。如本文使用的术语"SBC-102"是指重 组人溶酶体酸性脂肪酶。LAL在文献中还被称为酸胆固醇酯水解酶、胆固醇酯酶、脂肪酶A、 LIPA以及固醇酯酶。
[0048]LAL催化胆固醇酯和甘油三酯水解为游离胆固醇、甘油和游离脂肪酸。因此，"LAL活性"可以例如通过荧光底物4-甲基伞形酮油酸酯(4MU0)的裂解来测量。4MU0的裂解可以 例如通过所释放的焚光团（flurophore)4_甲基伞形酮(4MU)在约360nm处的激发和在460nm 处的发射来检测。结果可以以相对荧光单位(RFU)来报告。例如，在30分钟端点测定中裂解 的底物的量可以相对于4MU标准曲线来量化，并且一个活性单位(U)可以定义为在37°C下裂 解1微摩尔的4MU0/分钟所需要的酶的量。因此，LAL的功能性片段或变异体包括具有LAL活 性(例如，水解胆固醇酯和/或甘油三酯的能力）的片段或变异体。
[0049]如本文使用的"外源性LAL"是指非患者天然产生的LAL。例如，外源性LAL包括施用 至患者的重组LAL蛋白、分离自人或动物并且施用至患者的LAL蛋白以及由于施用编码LAL 的RNA和/或DNA或增加内源性LAL蛋白表达的另一种治疗而在患者中产生（即表达)的LAL蛋 白。
[0050] "静脉内注射"在医学上经常称为IV推注或团注，是指以下施用途径:其中注射器 被连接IV接入装置，并且药剂被直接注射，通常快速注射，并且如果它可能引起静脉刺激或 过于快速的作用，则有时持续至多15分钟的时间。一旦药物被注射到IV管的流体流中，则必 须有一些手段来确保它从管中到达患者。通常，这通过以下来完成：允许流体流正常流动， 并且由此携带药物至血流中。然而，在一些情况下，在第一注射之后使用第二流体注射(有 时称为"冲洗(flush)"），以促进药物进入血流。
[0051] "静脉内输注"是指以下施用途径:其中药剂在延长的一段时间内进行递送。例如， 药剂可以在1至8小时之间的一段时间内递送至患者。药剂还可以在约1、约2、约3、约4、约5、 约6、约7或约8小时的时期内递送至患者。为了完成静脉内输注，可以使用IV重力滴注或IV 栗。当患者仅仅在某些时刻需要药剂并且不需要另外的静脉内流体(例如，水溶液，其可含 有氯化钠、葡萄糖或其任意组合)时，通常使用IV输注，所述静脉内流体如恢复电解质、血糖 以及水损失的那些流体。
[0052]如本文使用的术语"禽类"是指分类学鸟纲的生物体的任何种、亚种或属，如但不 限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦以及平胸鸟，包括鸵鸟、鸸鹋以及食火 鸡。所述术语包括原鸡(Gallusgallus)或鸡的各种已知品种（例如，白色来亨鸡(White Leghorn)、棕色来亨鸡（BrownLeghorn)、横斑芦花鸡（Barred-Rock)、苏塞克斯鸡 (Sussex)、新汉夏鸡(NewHampshire)、罗德岛鸡(RhodeIsland)、澳洲黑鸡(Australorp)、 米诺卡鸡(Minorca)、芦花鸡(Amrox)、加州灰鸡(CaliforniaGray))，以及火鸡、野鸡、鹤 鹑、鸭、鸵鸟以及通常以商业数量饲养的其它家禽的品种。它还包括在发育的所有阶段的单 个禽类生物体，包括胚胎和胎儿阶段。
[0053]术语"家禽得到的"或"禽类得到的"是指由家禽产生或获得的组合物或物质。"家 禽"是指可以作为禽畜饲养的禽类，包括但不限于:鸡、鸭、火鸡、鹤鹑以及平胸鸟。例如，"家 禽得到的"可以指鸡得到的、火鸡得到的和/或鹌鹑得到的。
[0054] 如本文使用的术语"患者"是指正在接受或已经接受或准备接受例如由医学护理 提供者所指导的医学护理或治疗的任何人。
[0055]如本文使用的"治疗有效剂量"是指产生希望的治疗反应所需的药物的剂量(例如 量和/或间隔）。治疗有效剂量是指一种剂量，相比于未接受这种剂量的对应受试者，所述剂 量使得疾病、病症或副作用得到改善的治疗、治愈、预防或改善，或者疾病或病症的发生率 或恶化率降低。所述术语在它的范围内还包括有效增强生理功能的剂量。
[0056]术语治疗（"treat"、"treating"以及"treatment"）是指减轻、减缓或改善疾病或 症状、预防附加症状、改善或预防症状的潜在病因、抑制疾病或病症、阻止疾病或病状的发 展、缓解疾病或病状、引起疾病或病状好转、缓解由疾病或病状引起的病状、或预防性和/或 在症状已发生之后停止疾病或病状的症状。
[0057]如本文关于特定剂量使用的"kg^1"、"每kg"、"/kg"和"每公斤"表示哺乳动物的"每 公斤体重"，因此这些术语可互换使用。
[0058]如本文使用的术语"多肽"意欲涵盖单个"多肽"以及多个"多肽"，并且是指由通过 酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语"多肽"是指两个或更多个 氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、"蛋 白质"、"氨基酸链"或用于表示具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其它术语 都被包括在"多肽"的定义内，并且术语"多肽"可以代替或与任何这些术语互换使用。术语 "多肽"还意欲表示多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酰化、酰胺化、 通过已知保护/阻断基团而衍生化、蛋白水解性裂解、或被非天然存在的氨基酸修饰。多肽 可以衍生自天然生物来源或由重组技术产生，但不必从指定核酸序列翻译。它可以以任何 方式产生，包括通过化学合成。
[0059]如本文所使用，两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性百分率等于这两 个序列之间的同一性百分率。两个序列之间的同一性百分率是由序列共享的相同位置的数 量的函数（即，同源性％=相同的位置的数量/位置的总数X100)，其中考虑了为优化两个 序列的比对而需要引入的间隙数和各间隙的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分 率的确定可以使用数学算法来完成，如以下在非限制性实例中所述。
[0060] 两个氨基酸序列之间的同一性百分率可以使用已被并入ALIGN程序(版本2.0)中 的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci·，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重 残基表，间隙长度罚分12,和间隙罚分4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分率 可以使用已被并入到GCG软件包(在http://www.gcg .com可得）中的GAP程序中的Needleman 和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453( 1970))算法，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，间隙 权重16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。
[0061] "分离的"多肽或其片段、变异体或衍生物意欲为不在它的天然周围环境中的多 肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以是从它的原生或天生环境中移出的。如 本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何适 合的技术分离、分开、或者部分或实质性纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。
[0062]本文公开的其它多肽是上述多肽的片段、衍生物、类似物、或变异体以及其任意组 合。当谈到本文公开的任何多肽时，术语"片段"、"变异体"、"衍生物"以及"类似物"包括保 留对应的天然多肽的至少一些活性的任何多肽(例如，保留水解胆固醇酯和/或甘油三酯的 能力的LAL多肽片段、变异体、衍生物以及类似物）。多肽片段包括例如蛋白水解片段、以及 缺失片段。多肽变异体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变 的氨基酸序列的多肽。变异体可以天然或非天然存在。非天然存在的变异体可以使用本领 域已知的诱变技术来产生。变异型多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍 生物是已经被改变以展现出在原生多肽上未发现的另外的特征的多肽。实例