肾上腺素。对于相关生物产品，大部分延迟的IRR在输注后超过24小时发生。症状包括关节 痛、肌痛、流感样症状、头痛、疲倦以及皮疹或荨麻疹。延迟的反应可以用临床上指示的镇痛 药或抗组胺剂来治疗。IRR分类为急性(开始输注24小时内发生)或延迟(在输注后1天与6天 之间发生）。用于治疗超敏性反应的药剂和设备对于在未预料的严重的超敏性反应的情况 下立即使用来说必须可获得。这些供应物包括但不局限于氧气、对乙酰氨基酚、抗组胺剂 (例如苯海拉明，肠胃外和P0)、皮质类固醇、肾上腺素以及心肺复苏装置。在类似的生物产 品中，大部分急性IRR在输注24小时内发生(Cerezyme?、VPRIV1'、Fabrazyme?处方信 息）。可能的急性IRR的迹象可以分类为:轻度至中度IRR:充血、潮红、发烧和/或寒战、恶心、 瘙痒、荨麻疹、胃肠症状(呕吐、腹泻、腹部绞痛）。轻度反应定义为在暂时停止或降低输注速 率后自我限制性、自发消退的反应。中度反应定义为用简单的措施未消退，要求延长的观察 和治疗中断的反应。严重的IRR伴有胸痛、呼吸困难、哮鸣、喘鸣、低血压或高血压、呼吸停 止、呼吸暂停、呼吸困难、心动徐缓或心动过速。在输注过程中如果观察到上述迹象和症状 中的任一种，并且受试者保持血液动力学稳定，那么输注速率可减慢(降低至事件发作时所 给予的速率的一半，例如由l〇mL·hr-1降至5mL·hr-〇，并且输注时间延长。在事件消退后， 输注应该在降低的速率下持续最少30分钟，之后速率增加至输注方案中初始速率的75%。 如果受试者继续显示出超敏性的迹象，根据在小于2岁的儿童中用于输注反应管理的制度 指南，可以施用頂或低IV剂量的抗组胺剂。
[0229] 实施例7
[0230] 向患有迟发性LAL缺乏的人患者施用rhLAL
[0231] 所述研究的主要目标是评估SBC-102在由于迟发性LAL缺乏而患有肝功能障碍的 患者中的安全性和耐受性(生命体征、身体检查、临床实验室检验、免疫原性检验、不良事件 评价、并行治疗）。次要目标是表征通过IV输注递送的SBC-102在单次和多次剂量(在第0天 和第21天的输注前后)之后的药物代谢动力学。迟发性LAL缺乏受试者的纳入标准如下：
[0232] 1.患者了解所述研究的全部性质和目的，包括可能的风险和副作用，并且愿意且 能够遵守所有研究程序并提供了知情同意；
[0233] 2.男性或女性患者2 18岁并且< 65岁；
[0234] 3.相对于进行测定的正常实验室范围，证明的LAL活性下降，或确诊LAL缺乏的证 明的分子遗传学测试结果；
[0235] 4.基于临床呈现(肝肿大）和/或实验室检验结果(ALT或AST2 1.5XULN)，肝损害 的证据；
[0236] 5.如果正用斯达汀或依泽替米贝，那么在筛选之前患者必须处于稳定剂量持续至 少4周；
[0237] 6.所有女性在筛选时必须具有阴性血清妊娠检验并且不能哺乳;并且
[0238] 7.有生产可能的女性患者必须同意使用高度有效且经过批准的避孕法，持续整个 研究时间并且在最后一个剂量后继续使用30天。
[0239]临床评价包括身体检查、尿分析、临床化学分析、CBC/血液学、急性期反应物、凝结 研究、12导联ECG、抗SBC-102抗体、以及PK，以获得Cmax、AUCinf、Ti/2、C1以及Vss。
[0240]在2小时内经由静脉内（IV)输注每周一次向患者给予0.35mg·kg<、lmg·kg<或 3mg·kg^1的LAL。向第一位受试者给药并且在进行所述组群中的其它受试者的给药之前监 控耐受性，持续至少24小时。各受试者在他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人， 持续24小时。受试者继续另外3个剂量的每周一次的SBC-102剂量的IV输注，条件是耐受性 和安全性保持可接受。
[0241 ]药物代谢动力学
[0242]使用进入研究的接受至少一个剂量的研究药剂的所有受试者分析PK数据，但排除 可能受主要方案偏差影响的任何数据点。使用单室输注模型进行PK分析。获得以下PK参数 并由组群呈现(〇1^^六1](：11^、1'1/2、(：1以及￥ 55)。使用第2次就诊和第6次就诊的数据比较单次 和多次剂量PK参数。
[0243] 在本研究中剂量之间的建议增量可以是3、4、5或6倍，这可以允许以mg·kg^1计跨6 倍剂量范围评价在人体中的初始安全性、耐受性以及药物代谢动力学。在相关的临床前大 鼠模型中，lmg·kg-1每周一次、3mg·kg-1每两周一次以及5mg·kg-1每周一次的药效学作用 是相当的。因此，虽然并未预期受试者需要大于3mg·kg^1每周一次的剂量，但取决于疾病的 严重性可以考虑大于3mg· 1^1 如4、5、6、7、8、9Sl0mg*kg1^l^。
[0244] 研究设计
[0245] 考虑到患有此病状的患者的罕见性，用于本研究的目标数量是9位可评估的受试 者。受试者被征募到三个连续组群中，每个组群3位受试者。被分配到组群1的受试者开始第 一次给药，接着是那些分配给组群2的受试者，然后是在组群3中给药。
[0246 ]表4:迟发性LAL缺乏研究方案:就诊、评价以及间隔 [0247]
[0249]TC=电话呼叫 [0250]P给药前
[0251] 1包括饮酒史(AUDIT问卷调查）
[0252] 2包括身高和体重
[0253] 3给药前、输注期间每15分钟、输注后2小时内每15分钟、和输注后2-4小时内每30 分钟
[0254] 4第1次就诊和第8次就诊时的血清;第2次就诊和第6次就诊时的尿
[0255] 5给药前，输注期间10、15、20、40、60、90分钟，输注结束时（约120分钟）和输注后5、 10、20、30、40、60以及120分钟
[0256] 组群 1
[0257] 3位受试者接受0.35mg·kg<的SBC-102的IV输注。对第一位受试者给药并且监控 耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它2位受试者的给药。各受试者在他们第 一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个0.35mg·kg<的 IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。
[0258] 组群 2
[0259] 3位受试者接受lmg·kg<的SBC-102的IV输注。对组群2中的第一位受试者给药并 且监控耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它2位受试者的给药。各受试者在 他们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个lmg· kg"1的IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。
[0260] 组群 3
[0261] 3位受试者接受3mg·kg<的SBC-102的IV输注。对组群3中的第一位受试者给药并 且监控耐受性持续至少24小时，随后进行所述组群中的其它受试者的给药。各受试者在他 们第一次输注SBC-102之后仍保持为住院病人，持续24小时。受试者继续另外3个3mg·kg< 剂量的每周一次的IV输注，条件是耐受性和安全性可接受。
[0262] 由于耐受性差或潜在安全性风险，安全委员会(SC)可以在任何点停止整个组群的 给药或停止单个受试者的给药。
[0263] 如果受试者在除了第8次就诊(研究结束）以外的计划就诊时或在未计划的就诊时 中断研究治疗，那么受试者应在最后一次剂量的SBC-102后不早于7天返回，用于结束在第8 次就诊时进行的研究评价。
[0264]在第2、4、5以及6次就诊时通过IV输注施用SBC-102。在研究期间始终记录并行治 疗。从签署知情同意之时记录不良事件。
[0265]各受试者接受总计4周剂量的SBC-102,条件是耐受性和安全性保持可接受。
[0266] 研究持续时间
[0267]所述研究包括4周的SBC-102给药和支持安全性与用于后续临床试验的给药方案 的评估的洗脱期。在完成本研究之后，受试者适合于在另一方案下继续SBC-102,以便评价 SBC-102在患有LAL缺乏/CESD表型的患者中的长期安全性和功效。
[0268] 身体检查
[0269] 由有行医资格的人士进行全身身体检查。应指定并记录系统（包括但不限于心血 管、呼吸、胃肠道以及神经系统）。在每次进行检查时应说明任何异常。适用时，应将新诊断 出的异常记录为不良事件。
[0270] 在筛选就诊时待进行的其它身体检查评价：
[0271] a)肝脏大小：进行肝脏大小（可触及/不可触及，和肋缘下的厘米数）、规则性（光 滑/有结节）以及敏感性(触痛/非触痛)的临床评价。
[0272]b)淋巴结病:进行任何可触及的淋巴结的大小、位置以及特点的评价。待检查的区 域包括:头部(枕骨、耳前、耳廓后、颏下、下颂下）、颈部、锁骨、腋窝以及腹股沟。任何增大的 结节被表征为触痛或非触痛。
[0273]c)动脉病：临床上评价右和左胫骨后与足背脉搏，并且记录右和左踝肱指数 (ABIhABI被定义为足背或胫骨后动脉的收缩压除以右或左臂的臂收缩压（以较高者为准） 的比率。
[0274] 生命体征
[0275]测量生命体征，包括脉搏率、呼吸率、收缩期和舒张期血压以及体温。在受试者处 于半仰卧位置至少5分钟之后进行脉搏率和血压的评价。在给药的当天，在输注前、输注期 间和输注后2小时内每15分钟（±5)，并且然后在输注完成后的2小时与4小时之间每30分钟 (±10)记录生命体征。其它读数可以在输注相关的反应（IRR)事件中根据研究人员的判断 获取。在受试者已经仰卧至少5分钟之后获取具有正式记录的12-导联心电图（ECG)。
[0276]实验室评价
[0277] 在评价方案中指示的各时间点收集样品用于实验室检验。进行以下分析（除了 ESR、凝结研究以及抗SBC-102抗体以外）。
[0278] CBC/血液学：白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血球密度、平均血细胞比容 (MCV)、平均血细胞血红蛋白含量(MCH)、平均血细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数、嗜 中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞
[0279] 化学组:葡萄糖、尿氮、肌酸酐、钠、钾、氯化物、钙、镁、无机磷、总蛋白质、乳酸脱氢 酶、尿酸
[0280] 肝功能检验:AST/SG0T、ALT/SGPT、碱性磷酸酶、GGTP、白蛋白、胆红素(直接、总）
[0281] 脂质组:总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL
[0282] 凝结研究:凝血酶原时间（PT)、国际标准化比率（INR)、活化部分促凝血酶原激酶 时间(aPTT)
[0283] 尿分析:葡萄糖、酮、血液、pH、蛋白质、亚硝酸根以及白细胞（只有在血液、蛋白质、 亚硝酸根和/或白细胞异常时，进行显微镜检查）
[0284] 病毒性肝炎筛选:HBsAg和HCV血清学(在筛选时或如果在试验期间临床上有指示）
[0285] 自身免疫性肝炎筛选:抗平滑肌抗体(ASMA)、抗核抗体(ANA)、抗LKM1抗体、抗SLA 抗体
[0286] 抗药物抗体:抗SBC-102抗体
[0287] 急性期反应物:高敏感性C反应性蛋白（CRP)、红细胞沉降率(ESR)以及血清铁蛋白
[0288] 妊娠检验:所有女性至少每月进行妊娠检验。这些检验使用在第1次就诊和第8次 就诊时的血清以及第2次就诊和第6次就诊时的尿来进行。
[0289]药物代谢动力学(PK)评价：自与输注套管相对的臂上取PK样品。在第0天(剂量1， 第2次就诊)和第21天(剂量4，第6次就诊)集中收集样品用于测量SBC-102血清水平：临给药 前（给药30分钟以内）；在输注期间10(±1)、15(±1)、20(±1)、40(±2)、60(±2)以及90(± 2)分钟；和在输注结束时(约120分钟）；以及在输注完成后5( ± 1)、10( ± 1)、20( ± 1)、30( ± 1)、40(±2)、60(±2)以及120(±2)分钟。
[0290] 制备SBC-102
[0291] 将第1次就诊时记录的受试者的体重用于计算用于每次输注的SBC-102体积。使用 以下步骤通过稀释制备用于IV输注的SBC-102药品：
[0292] 1.将小瓶自冷冻器移出。
[0293] 2.确认小瓶上的有效期尚未过期。
[0294] 3.确定给药所需的SBC-102的计算总体积。
[0295] 实例：
[0296] 受试者体重(按kg计）：70kg
[0297] 受试者剂量水平:3mg·kg一1
[0298] 药物浓度：2 ·Omg·mL-1
[0299] 1 ·计算受试者剂量
[0301] 2.计算注射体积：
[0303] 4.基于给药组分配，使用以下0.9 %盐水输注袋：
[0305] 5.从1OOmL或250mL的0.9 %盐水的输注袋中移出等于给药所需的SBC-10 2体积(如 以上步骤3中所计算）的体积（S卩，使用以上实例，将105mL的盐水从250mL的输注袋中移出）。 [0306] 6.将计算的SBC-102总体积抽取并转移到0.9%盐水输注袋（S卩，使用以上实例，将 105mL的SBC-102溶液抽取并转移到输注袋中）。
[0307] 7.使用温和的倒转来混合袋。
[0308] 施用rhLAL
[0309] 1 ·将IV输注管连接至SBC-102的稀释袋。
[031 0] 2·将管灌注，并且排出所有空气。
[0311 ] 3.流量调节装置的输注速率被设定为在约100分钟内以以下速率施用总体积：
[0314] 4.选择IV输注部位，它随受试者不同并且可以包括肘前或腕静脉(或中心静脉导 管)。
[0315] 5.将IV导管连接至血管导管。将盐水注射至IV管线中，以评价开放性并验证盐水 容易冲洗。
[0316] 6.用胶带将IV管线固定。
[0317] 7.使用流量调节装置开始SBC-102输注。
[0318] 8.定期监控输注。
[0319] 9.当袋排空时，使用注射端口将25mL的0.9%盐水立即注射到输注袋中。
[0320] 10.在相同输注速率下对管线进行冲洗(对于0.35mg·kg4和lmg·kg4剂量，为 60mL/小时[lmL/分钟]，并且对于3mg·kg<剂量，为150mL/小时[2.5mL/分钟])，直到完成输 注。输注结束被定义为输注和冲洗已经完成并且有文件记载时。
[0321]输注反应
[0322] 输注相关的反应(IRR)被定义为任何免疫介导的至少有可能与输注相关的不良事 件。IRR被分类为急性(开始输注24小时内发生)或延迟(在输注后1天与14天之间发生）。
[0323] 用于治疗超敏性反应的药剂和设备对于在未预料的严重的超敏性反应的情况下 立即使用来说必须可获得。它们包括但不局限于氧气、对乙酰氨基酚、抗组胺剂（例如苯海 拉明，肠胃外和P0)、皮质类固醇、肾上腺素以及心肺复苏装置。
[0324] 可能的急性IRR的迹象可以为充血、潮红、发烧和/或寒战、恶心、瘙痒、荨麻疹、胃 肠症状(呕吐、腹泻、腹部绞痛）、心肺反应，包括胸痛、呼吸困难、哮鸣、喘鸣、低血压或高血 压。如果在输注期间观察到任何以上迹象和症状并且受试者仍保持血流动力学稳定:输注 速率必须减缓或停止。如果受试者继续显示超敏性的迹象，应施用抗组胺剂的IM或缓慢IV 剂量。在经历具有临床上明显的心血管或呼吸作用的严重输注反应的受试者中，中断输注。 在所述过敏反应中，受试者可以用静脉内抗组胺剂、皮质类固醇以及肾上腺素来治疗。
[0325] 实施例8
[0326] 在大鼠模型中施用重组LAL
[0327] 在Yoshida和Kuriyama( 1990laboratoryAnimalScience,第40卷，第486-489页 (还参见Kuriyama等（1990)JournalofLipidResearch,第31 卷，第1605-1611 页； Nakagawa等，（1995)JournalofLipidResearch,第36卷，第2212-2218页)所述的LAL缺乏 Donryu大鼠中评估重复给予重组人LAL对体重、组织甘油三酯和胆固醇、肝肿大、脾肿大、淋 巴结病、肠重以及其它参数的影响，所述文献的公开内容是以引用的方式整体并入本文。在 4周龄时，将对于LAL缺失为纯合(LAL-/-)的Donryu大鼠分成给予重组人LAL(在转基因鸡输 卵管系统中产生)或盐水安慰剂的组。将野生型年龄匹配的同窝出生大鼠用作对照。通过尾 静脉注射以单次剂量或以按30分钟间隔给予的两个相等剂量，对LAL-/-大鼠每周给药一 次，持续4周(总计给药4次），或者每两周给药一次，持续4周(总共给药2次）。重组LAL的剂量 为lmg/kg或5mg/kg。给药方案示于表5中。大鼠用苯海拉明（5mg/kg)预治疗以抵消潜在的过 敏性反应，其程序是基于在用于治疗溶酶体贮积病的酶替代疗法的动物模型中的以前的经 验（Shull等.（1994)ProceedingsoftheNationalAcademyofScience,第91卷，第 12937页；Bielicki等.（1999)TheJournalofBiologicalChemistry,274,第36335页； ￥〇区161'等.（1999)?6(1丨31：1'；^1^8631^11，45，第838页.），所述文献的公开内容以引用的方式 整体并入本文。
[0328] 图9示出施用每周lmg/kg的重组LAL或每周5mg/kg的重组LAL或每两周5mg/kg的重 组LAL的大鼠的增重的每日进展。在图中可见，在两个剂量大小和频率之间的治疗作用中差 异很小或没有差异。
[0329] 表5:LAL缺乏Donryu大鼠的称重和给药方案
[0330]
[0331] 实施例9
[0332] 用重组LAL治疗的LAL-/-大鼠的病理学检查
[0333] 在实施例8所述的研究结束时，将研究动物人道地安乐死，并且进行尸检以检查宏 观病理学、组织病理学以及临床化学。宏观尸检包括检查身体的外表面、所有孔窍以及颅 腔、胸腔和腹腔以及它们的内容物。测定大鼠的内部器官和组织的质量，并且收集器官和组 织，并固定在10%中性缓冲的福尔马林中。在固定后，将组织进行处理并且制备苏木精和曙 红染色的切片的组织载玻片并加以评价。
[0334]分析的治疗动物的宏观病理学检查显示肝脏大小和颜色得到实质性正常化，如在 图10中示出的解剖标本中可见。测定了器官与体重的比率，并且证实了相比于安慰剂治疗 的大鼠，被解剖的成功治疗的动物的肝脏、脾脏、肠系膜组织、十二指肠、空肠以及回肠的相 对器官大小减小。分析的重组LAL治疗的大鼠的肝脏组织的组织病理学显示基本上正常的 肝脏组织学，这与泡沫状巨噬细胞在安慰剂治疗的动物中的实质性积聚形成明显对照（图 10)〇
[0335] 实施例1〇
[0336] 重组人LAL在巨噬细胞和成纤维细胞溶酶体中的内化
[0337]在活体外使用巨噬细胞和成纤维细胞检查转基因禽得到的重组人LAL( "SBC-102"）结合细胞并内化至溶酶体代谢区中的能力。当与巨噬细胞一起孵育时，发现荧光标记 的SBC-102定位至溶酶体。这种作用可以通过使用甘露糖多糖竞争剂来削弱，暗示N-乙酰基 葡糖胺/甘露糖(GlcNAc/甘露糖)受体作为这些细胞的识别和摄取机制。在活体外孵育后， SBC-102增加了LAL缺乏人成纤维细胞和正常鼠类成纤维细胞中的细胞相关的LAL活性，表 明暴露至SBC-102可以使得缺乏的酶活性被实质性替代。
[0338]甘露糖-6-磷酸(M6P)存在于SBC-102的寡糖结构中，所述寡糖结构已经显示参与 溶酶体酶经由普遍存在的M6P受体递送至多种细胞类型中。
[0339] 重组LAL是从转基因母鸡的卵白中纯化。OregonGreenNHS获自Invitrogen?(#〇-10241)。大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383和小鼠成纤维细胞系NIH-3T3获自ATCC。缺乏LAL的沃 尔曼氏病成纤维细胞获自CoriellInstituteforMedicalResearch，并且 LysoTracker?Red获自Invitrogen?。
[0340]酶标记:根据生产商的推荐，将PBS中的4mg的转基因禽得到的LAL用OregonGreen 进行标记，随后将反应相对于PBS透析，然后浓缩。
[0341 ]巨噬细胞摄取:将荧光标记的转基因禽得到的LAL(5ug/rnL)和LysoTracker?Red 与NR8383细胞一起孵育2小时。通过共聚焦荧光显微术使用顺序扫描模式在488nm并且然后 在514nm下检查细胞。
[0342]甘露聚糖的竞争抑制：将荧光标记的SBC_102(5ug/mL)和甘露聚糖与NR8383细胞 一起孵育2小时。将细胞用胰蛋白酶处理，并且通过荧光活化的细胞分选使用中值荧光强度 作为终点来测量重组LAL摄取。
[0343] 使用巨噬细胞细胞系NR8383来检查转基因禽得到的LAL被吸收并且然后并入到靶 细胞的溶酶体中的能力。将荧光标记的转基因禽得到的LAL和溶酶体标记物" _Lys〇Tracker?Red"（InVitr〇gen?)与细胞一起孵育2小时。随后通过共聚焦荧光显微术使 用顺序扫描模式来检查转基因禽得到的LAL和溶酶体标记物在这些细胞的溶酶体中的共定 位（图11)。重组LAL证实了定位至溶酶体，这与使用来自多种来源的重组人(rhLAL)的类似 活体外研究一致。
[0344] 转基因禽得到的LAL与GlcNAc/甘露糖受体的结合特异性通过竞争结合测定使用 巨噬细胞细胞系NR8383来评价（图12)Jyg/mL的荧光标记的（OregonGreen)转基因禽得到 的LAL和各种浓度的含甘露糖的寡糖甘露聚糖与细胞一起共孵育2小时。转基因禽得到的 LAL的摄取被甘露聚糖的相对抑制(如与没有甘露聚糖对照相比较)通过荧光活化的细胞分 选分析使用中值荧光强度作为终点来量化。观察到转基因禽得到的LAL结合/摄取的甘露糖 剂量依赖性抑制，这与转基因禽得到的LAL:G1cNAcR的相互作用一致。
[0345] 另外，在成纤维细胞中甘露糖-6-磷酸介导的摄取通过使用甘露糖-6-磷酸的竞争 实验得以证实。
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