抑制酪蛋白激酶2活性在促进i型干扰素表达的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学治疗领域。具体地，本发明涉及酪蛋白激酶2抑制剂在促进I 型干扰素及其下游基因表达中的新用途。
【背景技术】
[0002] I型干扰素包括IFNa和IFN0两种，它们与细胞表面的干扰素受体结合后激活蛋 白激酶Jakl和Tyk2,随后活化转录因子STAT1或/和STAT2,诱导上百种基因的表达（干 扰素诱导基因，ISGs)，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10 等。
[0003] 干扰素诱导的这些基因在细胞的繁殖和凋亡、血管生成、T细胞免疫反应等过程中 起着重要的生理作用。因此I型干扰素在免疫相关性疾病中的应用得到了广泛的研究。
[0004] I型干扰素的表达是受模式识别受体（PRRs，PatternRecognitionReceptors)及 其介导的信号通路所诱导的。这些模式识别受体包括Toll样受体（Toll-likereceptors/ TLRs)、NOD样受体（NOD-1ikereceptors/NLRs)、RIG-I样受体（RIG-I-1ikereceptors/ RLRs)和胞衆内DNA受体（cytosolicDNAsensors，Q)Ss)通过识别组织中死亡的细胞所 分泌的RNA和DNA等"模式分子"（PAMPs，Pathogen-AssociatedMolecularPatterns)，激 活复杂的信号通路（包括蛋白激酶TBK1、IKKα/β和MAPkinases)，活化关键性的转录因 子IRF3、NFκB和AP-1等，诱导I型干扰素、细胞因子和趋化因子的表达，激活天然免疫和 适应性免疫反应，实施宿主防御和组织修复等生理功能。
[0005] 但是I型干扰素表达过量或异常也会引起疾病，特别是系统性红斑狼疮等自身免 疫性疾病，因此体内往往存在调控I型干扰素的负调节机制，以避免干扰素的异常表达。这 些调控机制往往导致在病理状态下，I型干扰素也不能有效的表达，从而导致各种免疫反应 不足的相关性疾病。因此如何在病理状态下，突破机体调控I型干扰素表达的机制，从而有 效地治疗免疫相关性疾病，是基础和临床医学领域研究的一个重要课题。
[0006] 因此，本领域迫切需要开发一种提高人体自身I型干扰素表达，提高人体免疫功 能的有效方法，以治疗多种感染性和非感染性的人类疾病。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种CK2抑制剂在促进I型干扰素表达中的应用。
[0008] 本发明第一方面，提供了一种酪蛋白激酶2(Caseinkinase2,CK2)抑制剂的用 途，（i)用于制备促进I型干扰素（IFNa/β)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的 药物组合物；和/或（ii)用于制备治疗和/或预防I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合 物。
[0009] 在另一优选例中，所述的CK2来源于哺乳动物，较佳地，来源于人、小鼠、大鼠。
[0010] 在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏是指在疾病发生前和或/疾病发生后，I 型干扰素表达量和/或活性的降低。
[0011] 在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏相关疾病是指缺乏I型干扰素会导致疾 病的发生和/或加重、且提高I型干扰素的表达量和/或活性后能够对所述疾病起到治疗 和/或预防作用的疾病。
[0012] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括CK2的反义核酸、抑制性microRNA、抗体或小 分子化合物。
[0013] 在另一优选例中，所述的抗体包括小分子多肽。
[0014] 在另一优选例中，所述的抑制剂为CK2基因的siRNA、shRNA。
[0015] 在另一优选例中，所述的CK2基因的shRNA如（SEQIDNO. : 1-2所示）
[0016]Forward(SEQIDNO. :1):
[0017] 5'CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG3' ；
[0018] Reverse(SEQIDNO. :2):
[0019] 5' AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG 3'。
[0020] 在另一优选例中，所述的CK2蛋白的氨基酸序列的Genbank登录号为 ΝΡ_031814· 2 (小鼠）和ΝΡ_808227· 1 (人）。
[0021 ] 在另一优选例中，所述的CK2蛋白的编码核苷酸序列的Genbank登录号如ΝΜ_007788· 3 (小鼠）和NM_177559 (人）所示。
[0022] 在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏相关疾病包括：病毒感染性疾病、恶性肿 瘤、多发性硬化。
[0023] 在另一优选例中，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的病毒的疾病：单纯疱 疹病毒（HSV)、水泡病毒（VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒（KSHV)、呼吸道合胞病毒（RSV)、手足 口病病毒（肠道病毒EV71和CA16)乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人类获得性 免疫缺陷病毒/艾滋病病毒（HIV);和/或
[0024] 所述的恶性肿瘤包括以下肿瘤：多毛细胞白血病（hairycellleukaemia)、慢 性髓性白血病（CML)、淋巴瘤（lymphoma)、骨髓瘤（myeloma)、黑色素瘤（melanoma)、肾细 胞癌与膀脫癌（renalcellandbladdercellcarcinoma)、卡波希氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)〇
[0025] 在另一优选例中，所述的病毒为感染细胞后能够激活模式识别受体的病毒。
[0026] 在另一优选例中，所述的抑制剂还用于抑制病毒和/或肿瘤细胞的免疫逃逸。
[0027] 在另一优选例中，所述CK2抑制剂还用于抑制病毒的复制和组装。
[0028] 在另一优选例中，所述的I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达 包括诱导产生和/或提高I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达量和/或 活性。
[0029] 在另一优选例中，所述的抑制剂为小分子化合物，较佳地，包括四溴苯三唑（TBB)、 CX-4945(Silmitasertib)、DMAT(2-二甲氨基-4, 5, 6, 7-四溴-1H-苯并咪唑）、山奈酚、 酪氨酸磷酸化抑制剂AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4_甲苯基）噻 吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸（TTP22)、CX-5011、鞣花酸（EllagicAcid)、3-甲 基-1，6, 8-三氢蒽醌（emodin)、4'，5, 7-三羟基黄酮（apigenin)。
[0030] 在另一优选例中，所述的I型干扰素诱导基因或其蛋白包括CXCL10/IP-10、 STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干扰素调节因子 3 (IRF3)。
[0031] 在另一优选例中，所述的I型IFN包括IFN-α、IFN-β。
[0032] 在另一优选例中，所述的药物组合物包括作为活性成分的CK2抑制剂，和药学上 可接受的载体。
[0033] 在另一优选例中，所述的CK2抑制剂的有效浓度为1-1000μM，较佳地，为 20-100 μΜ〇
[0034] 在另一优选例中，所述的CK2抑制剂对I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或 其蛋白的促进作用呈剂量依赖性。
[0035] 本发明第二方面，提供了一种体外非治疗性的促进细胞表达I型干扰素和/或I 型干扰素诱导基因或其蛋白和/或体外非治疗性的抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/ 或肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：在CK2抑制剂的存在下，培养细胞，从而促进细胞表达I 型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿 瘤细胞生长。
[0036] 在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞、或为DNA或RNA病毒感染的细胞。
[0037] 在另一优选例中，所述的方法还可用于制备I型干扰素或其诱导蛋白，例如收集 并纯化细胞培养体系中获得的I型干扰素或其诱导蛋白。
[0038] 本发明第三方面，提供了一种筛选能够抑制CK2的化合物的方法，包括步骤：
[0039] (a)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和 /或活性；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/ 或活性；
[0040] 其中，若试验组中I型干扰素的表达量和/或活性显著高于对照组，则说明所述的 候选化合物为能够抑制CK2的化合物和/或
[0041] (a2)在试验组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定细胞培 养体系中病毒的滴度；在对照组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定 细胞培养体系中的病毒滴度；
[0042] 其中，若试验组病毒的滴度显著低于对照组，则说明所述的候选化合物为能够抑 制CK2的化合物。
[0043] 在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
[0044] (b)对（a)中的化合物进一步测试其对酪蛋白激酶2或I型干扰素诱导基因或其 蛋白的促进作用。
[0045] 本发明第四方面，提供了一种制备I型干扰素的方法，包括步骤：
[0046] ⑴在CK2抑制剂的存在下培养细胞；
[0047](ii)收集、分离并纯化细胞培养液中的I型干扰素。
[0048] 在另一优选例中，在L929细胞中加入CK2抑制剂，在非感染条件下培养12-48小 时或者在病毒感染条件下培养12-24小时。收集上清，利用HPLC纯化I型干扰素。
[0049] 在另一优选例中，所述的细胞还包括成纤维细胞、或巨噬细胞。
[0050] 本发明第五方面，提供了一种CK2基因或其蛋白的用途，用于制备降低I型干扰素 和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物。
[0051] 本发明第六方面，提供了一种治疗病毒性感染的方法，向需要治疗的对象施用CK2 抑制剂，从而治疗病毒性感染。
[0052] 在另一优选例中，所述需要治疗的对象为哺乳动物，较佳地，为人。
[0053] 本发明第七方面，提供了一种（i)治疗I型干扰素缺乏相关疾病；和/或（ii)促 进I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物，所述的药物组合物 包括作为活性成分的CK2抑制剂，和药学上可以接受的载体。
[0054] 本发明第八方面，提供了一种判断CK2抑制剂是否对肿瘤或病毒有效的方法，包 括步骤：
[0055] (a)向肿瘤细胞或病毒感染细胞培养体系中加入CK2抑制剂；
[0056] (b)观察加入CK2抑制剂前后所述培养体系中I型干扰素的表达量和/或活性；
[0057] 其中，当加入CK2抑制剂后I型干扰素的表达量和/或活性II较加入之前的表达 量和/或活性10有显著升高，则说明CK2抑制剂对该肿瘤或病毒具有抑制作用。
[0058] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0059] 图1显示了CK2抑制Toll样受体信号所诱导的I型干扰素和/或I型干扰素诱 导基因或其蛋白，但不影响炎症因子TNFa的表达。
[0060] 图2显示了CK2抑制Toll样受体信号所诱导的TBK1和IRF3活化，但不影响MAP kinases的激活。
[0061] 图3显示了CK2抑制胞浆内识别RNA和DNA的模式识别受体所诱导的信号通路以 及I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达。
[0062] 图4显示了HSV感染时，CK2抑制小鼠巨噬细胞系Raw表达I型干扰素和/或I 型干扰素诱导基因或其蛋白，而随着I型干扰素及其靶基因产物的大量表达，HSV病毒的复 制、组装和释放受到显著的抑制，在CK2α敲降的Raw264. 7细胞培养液中检测到的HSV病 毒滴度比对照组的要低接近10倍。
[0063] 图5显示了仙台病毒感染时，CK2抑制小鼠成纤维细胞系L929表达I型干扰素和 /或I型干扰素诱导基因或其蛋白。
[0064] 图6显示了VSV病毒感染时，CK2抑制小鼠成纤维细胞系L929表达I型干扰素和 /或I型干扰素诱导基因或其蛋白。