专利名称：Rec2激酶的制作方法
1．发明领域本发明涉及分子遗传学和医学领域。详细地说，它涉及一个为某蛋白质编码的基因，这种蛋白质在哺乳动物细胞中是激酶并且参与细胞周期调控和受损基因组DNA的修复。该基因和蛋白质在此处分别称为hsREC2和hsRec2，与具有同源染色体配对和链交换活性的哺乳动物蛋白质RAD51处在同一超基因家族中，并且因为它与Ustilago maydis的同源配对链交换蛋白质具有同源性而被分离出来。鉴于这样的关系，这一基因和蛋白质也可被称为RAD51B和rad51B。
2．发明背景2.1 hsREC2的结构与功能在每一个生物体的生命过程中，它的细胞DNA不断地遭受到各种化学和物理事件使其结构改变即潜在的突变。这些潜在的突变因为DNA链间的错配而被细胞中的DNA修复酶识别。为了防止这些潜在突变固定下来后将发生的有害影响，所有生物体都有多种机制修复DNA错配。除此之外，比较高级的动物已经发展形成了这样的机制即如果细胞DNA损伤程度很大的话，细胞将会进入程序性死亡(“凋亡”)。
DNA错配修复和凋亡诱发通路的缺陷与肿瘤治疗的发展、进程和结果的关系已被医学家广泛认识，即使是不完全的理解。Chung,D.C.&Rustgi,A.K.,1995,Gastroenterology 109:1685-99；Lowe,S.W.,et al.,1994,Science 266:807-10.因而有必要去识别和克隆那些编码参与DNA修复和DNA错配监控蛋白质的基因。
通过对细菌、真菌和酵母的研究，已识别出从遗传学角度定义的三组参与错配修复过程的基因。这三组基因分别被称为切除修复组，倾向差错修复组和重组修复组。每组中一个基因的突变体会表现出有特征的表现型。酵母重组修复组突变体导致的表现型有对电离辐射极敏感，孢子形成过程不足和有丝分裂重组的缺失或减少。Petes,T.D.,et al.,1991,in Broach,J.R.,et al.,eds.,THE MOLECULAR BIOLOGYOF THE YEAST SACCHAROMYCES,pp.407-522(Cold Spring Harbor Press,1991).
几个与种族进化相关的基因已在重组修复组中找到大肠杆菌中的recA,Radding,C.M.,1989,Biochim.Biophys.Acta1008:131-145；酿酒酵母中的RAD51 Shinohara,A.,1992,Cell69:457-470,Aboussekhra,A.R.,et al.,1992,Mol.Cell.Biol.12:3224-3234,Basile,G.,et al.,1992,Mol.Cell.Biol.123235-3246；酿酒酵母中的RAD57 Gene 105:139-140；中的in U.maydis REC2,Bauchwitz,R.,&Holloman,W.K.,1990,Gene 105:139-288,Rubin,B.P.,et al.,1994,Mol.Cell.Biol.14:6287-6296。第三个酿酒酵母基因DMC1与recA相关，虽然DMC1突变体表现出细胞周期进程、重组和减数分裂过程中的缺陷，却不属于重组修复组。
REC2缺陷型U.maydis的突变体表现型其特征在于对电离辐射的极度敏感，有缺陷的有丝分裂和质粒间重组，以及不能进行完全的减数分裂。Holliday,R.,1967,Mutational Research4:275-288.UmREC2,即U.maydis的REC2基因产品，已经被广泛地研究过了。它是一个包含781个氨基酸的ATP酶，在ATP存在的情况下，能在多种条件下催化同源DNA链的配对，例如它催化变性的单链形成双螺旋DNA，催化双螺旋与单链的同源DNA间交换，和催化在同一单链间形成抗核酸酶复合体。Kmiec,E.B.,et al.,1994,Mol.Cell.Biol.14:7163-7172.UmREC2的独特之处在于它是唯一能与E.Coli酶recA一样催化形成同源配对的真核生物ATP酶。
美国专利申请，编号08/373,134,1995年1月17日提交，W.K.Holloman和E.B.Kmiec公开了从U.maydis中得到的REC2，生产重组UmREC2的方案和对它的应用方案。先于该发明日期之前一个REC2cDNA片段被IMAGE国际财团Lawrence Livermore国家实验室得到，称为质粒p153195，其大约400bp的序列已可在dbEST数据库中公开得到。
科学出版物标题基于REC2同源性的人和鼠基因的分离，1997年7月，Proc.Natl.Acad.Sci.94,7417-7422，作者Michael C.Rice等，公开了人和鼠REC2序列及人REC2cDNA序列，公开了辐射增加hsREC2在原代人上皮成纤维细胞中的转录水平。科学出版物Albala等著，1997年12月，Genomics46,476-479，也公开了相同的蛋白质和cDNA序列，并称之为RAD51B。一段，除了序列编码的C-末端14个核苷酸和3’-端非翻译序列之外与hsREC2序列相同的序列，由Cart wright R.等在1998年Nucleic Acids Research 26,1653-1659发表，称之为hsR51h2。hsREC2和hsR51h2被认为代表了同一原始转录本的不同的加工过程，这项专利申请发表于1998年3月19日的WO98/11214。
hsREC2的结构也公开在以下申请1996年9月11日递交，编号60/025,929；1997年9月11日递交，编号08/927,165；以及专利公开文本WO98/11214,1998年3月19日发表。
2.2细胞调控真核细胞周期包括4个时相G1期，S期(合成期)，G2期，M期(分裂期)。决定细胞所处时相和进入下一个时相的进程速度的相关生化事件是由一系列激酶，例如cdk2,cdc2等等所控制，而这些激酶又受与之相结合的称为细胞周期素的不稳定蛋白，例如cyclinD,cyclinE,cyclinA等的调控和激活。这些活化了的复合体依次去磷酸化其它那些能激活周期中某一特定时相所需酶的蛋白质。Reviewed,Morgan,D.O.,1997,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.15,261-291；Clurman,B.E.,&Roberts,J.M.,1998,in THE GENETIC BASIS OF HUMAN CANCER,pp.173-191(ed.byVogelstein,B.,&Kinzer K.W.,McGraw Hill,NY)(hereafterVogelstein)。
细胞周期在G1期包含一个关卡。在一定的条件下，例如染色体损伤或分裂素丧失，一个正常的细胞将不跨跃关卡继续前进。Rb和p53分别是参与与分裂素丧失和染色体损伤相关的G1期关卡的蛋白质。这些蛋白中任意一个的失活突变体与其他突变体一致会导致生长转化即变成恶性的细胞。而导入一个正常的p53或Rb基因则能抑制住转化的表现型。相关的基因，例如p53或Rb，它们的缺失与转化相关，一般称为“肿瘤抑制子”基因。导致家族性肿瘤综合症的常见原因就是肿瘤抑制子基因缺失复合体的遗传。Reviewed Fearson,E.R.,inVogelstein pp.229-236。
p53水平的升高是对染色体损伤的应答，然而，介导这个应答的机制仍是未知的。已知p53能被多种激酶磷酸化，而且这些磷酸化可以稳定p53蛋白。Reviewed Agarwal,M.L.,et al.,Jan.2,1998,J.Biol.Chem.273,1-4。
3．发明综述本发明的基础是出人意料地发现hsRec是一种丝氨酸激酶，它能将控制细胞周期的几种蛋白，特别是cyclinE和p53磷酸化。本发明许可从生理学的高度去确定细胞周期调控蛋白磷酸化位点。此外，Rec2酶活性的发现许可提供样品结构去发现Rec2特异的具有药理活性的拮抗剂和激动剂类化合物。
4．附图简述
图1A-1D图1A和1B显示hsRec2(SEQ ID NO:1)衍生氨基酸的序列。图1C和1D显示hsRec2 cDNA(SEQ ID NO:2)编码链的核苷酸序列。图1E和1F显示muRec2(SEQ ID NO:3)衍生氨基酸序列，图1G显示muRec2cDNA(SEQ ID NO:4)编码链的核苷酸序列。
图2A-2C图2A是hsREC2非标注的氨基酸序列。仅特别标注出核定位序列(“NLS”),A Box和B Box基元序列，DNA结合序列和丝氨酸型磷酸化位点(“P”)。
图2B是非标注的氨基酸序列的示意图，特别显示出80-200区域与recA有密切关系。
图2C和2D显示hsREC2和Ustilago maydis REC2的序列同源性。最相似的区域有高达43％的同源性。
图3A-3B图3A显示32P-ATP掺入髓鞘碱性蛋白(0.25mM)的时间作用曲线，REC2的浓度为1μl/30-40ul。图3B显示32P-ATP掺入肯普肽(LRRASLG,SEQ ID NO:5)在60分钟内对肯普肽浓度的作用曲线。
5．发明综述在这里，基因全都大写，例如hsREC2，而相应的蛋白质则首字母大写，例如hsRec2。
hsREC2活性的测定采用产生于杆状病毒的N-末端6组氨酰化衍生物。用杆状病毒产生的谷胱甘肽硫基转移酶结合的hsREC2和用大肠杆菌中产生的硫氧还蛋白结合的hsREC2得到了一致的结果。这些证实的结果倾向于要排除在Ni-NTA树脂上共纯化的内源性杆状病毒激酶的激酶活性。为了进一步排除纯化矫作物的可能性，Ni-NTA纯化了的6组氨酰-hsREC2由制备型SDS-PAGE进行进一步的纯化。结果发现仅有能被银染的含有hsREC2的部分仍保持激酶活性。
MuRec2和hsRec2的序列在350个氨基酸中仅有56个不同。本发明可以采用muRec2或hsRec2以及其氨基酸混合体组成的蛋白质，即蛋白质的某些位置氨基酸是muRec2的而另一些则是hsRec2的，以下称hs/muRec2的嵌合体实施。此外，在163位置的酪氨酸被取代的突变蛋白也适用于本发明的实施，例如Tyr-Ala。这样，本发明可进一步用hs/muRec2a1a163嵌合体实施。一个实施方案中这个取代可以是任何脂肪族氨基酸。另一个可替换的方案中该取代可以是除了半胱氨酸和脯氨酸之外的任何氨基酸。术语“Rec2激酶”这里用于代表的种类包括hsRec2,muRec2，所有hs/muRec2的蛋白嵌合体和Tyr163被取代的衍生物。术语人工Rec2激酶指的不仅仅是哺乳动物Rec2的Rec2激酶。术语哺乳动物Rec2在这里代表的蛋白质种类包括hsRec2和muRec2的哺乳动物同源体。
本发明能进一步可用融合蛋白实施，即包含有Rec2激酶或哺乳动物Rec2序列的蛋白质与一个能用于纯化最终融合蛋白的蛋白或多肽序列相融合所形成的融合蛋白。
自然状态存在的hsRec2和muRec2是磷蛋白，而磷酸化对于这些蛋白质的激酶活性来说不是必需的。本发明中术称的Rec2激酶和哺乳动物Rec2蛋白质既包括磷酸化也包括非磷酸化形式的蛋白质。
5.1细胞周期调控建立含有与CMV立即早期启动子hsRec2的片段可行连接的表达载体，并转柒到CHO细胞中。建立酪氨酸-163突变蛋白，即在src位点一个可磷酸化的酪氨酸(SEQ ID NO.8的8-11氨基酸)被丙氨酸所取代。。空白转染(neor),hsREC2转染和heREC2a1a163转染的细胞经受血清饥饿而同步化，释放。然后在不同的时间点通过定量流式细胞术测定DNA含量.hsREC2转染的细胞表现出了S期的延迟。这样，经过14个小时的释放后，75％的hsREC2转染细胞处于G1期而对照仅为36％。
hsREC2而非heREC2a1a163的过表达使细胞对UV照射敏感。CHO细胞接受UV剂量为15J/m2的辐射。然后再将细胞用定量流式细胞术分析，hsREC2细胞在照射后的24,48,72小时与对照相比较，都出现大量的凋亡。
5.2激酶活性
hsREC2可以在多种底物上显示激酶活性。人工底物例如髓鞘碱性蛋白，该蛋白已知是蛋白激酶C和蛋白激酶A的底物，它能被hsREC2磷酸化。肯普肽(leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)是一种已知的丝/苏氨酸激酶的底物，也能被磷酸化。此外，还有下列的重组蛋白能被hsREC2磷酸化P53,cyclinBl和cyclinE。cyclinB1/cdc2和cyclinE/cdk2的异二聚体也能被hsREC2磷酸化。对这些实验的解释其复杂性在于cyclinE/cdk2的自身磷酸化和cyclinB1/cdc2但没有cyclinE/cdk2能磷酸化hsREC2它本身。与cyclinB1/cdc2复合体相反，hsREC2不是一种自身磷酸化酶。
虽然heREC2a1a163在细胞中的表达对细胞周期无影响，但heREC2a1a163突变蛋白具有完全的激酶活性。
在侯选激动剂或拮抗剂存在的情况下，化合物相对于mREC2是否具有药理活性可通过测定mREC2的激酶活性来识别，尤其是hsREC2。特别优选的底物为cyclinE和P53。
5.3hsREC2与其它蛋白相结合在一个网织细胞溶胞产物系统中通过偶联转录翻译进行hsREC2的S35放射标记掺入。样品与HCT116细胞提取物相混合，在独立的反应中各种细胞蛋白质的单克隆抗体被加入，得到的抗体结合物通过蛋白质A葡聚糖分离出来，然后这些结合物通过SDS-PAGE和放射自显影来分析。当采用抗P53，抗PCNA和抗cdc2单克隆抗体时免疫沉淀中包含hsREC2，而当采用抗cdc4或抗cdk4单克隆抗体时没有hsREC2被沉淀下来。
5.25.4hsREC2激动剂或拮抗剂具有药理活性hsREC2的活性指示出对它活性的调节能使细胞对于由于发生遗传损伤，例如UV辐射之后，而进入的凋亡敏感或不敏感，以及能通过延长或缩短G1和S期来保护或去保护一个细胞免受DNA损伤。hsREC2激动剂和拮抗剂都是具有医务人员渴望得到的活性的化合物。发现属于hsREC2激动剂或拮抗剂的化合物对于药理科学是十分重要的。
在一个实施方案中，本发明是一个能决定某一化合物是否具有这样一种药理活性的方法，即通过测定该化合物对hsREC2激酶活性的影响来判断。在特定实施方案中，本发明是一种评估化合物对hsREC2和第二种激酶的相对影响的方法。例如，某一化合物是hsREC2的激动剂，但它对cyclinD/cdk4和cyclinE/cdk2没有或很少影响，将会导致阻断在G1期以及对遗传的损伤作出走向凋亡的应答。在具体的实施方案中，激酶的测定是用从P53,cdc2,cdk2或cyclinE组成的底物组中选择一个底物。另一可替换的方案是可采用一个模型底物，例如髓鞘碱性蛋白或肯普肽(leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)。
6．实施例6.1从Autographica californica杆状病毒感染体中生产重组hsREC2蛋白质为了便于构建hsREC2表达载体，限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ位点被添加到hsREC2 cDNA上。起始于71位核苷酸处的hsREC2 cDNA采用下列引物5’-GAG CTCGAG GGTACC C ATG GGT AGC AAG AAA C-3’(SEQID NO:6)扩增，它将XhoⅠ和KpnⅠ位点(下划线)置于起始密码子的5’端。重组分子包含hsREC2 cDNA的完整编码序列，能被XhoⅠ或KpnⅠ切割下来，并且在SEQ ID NO:2的1270和1280碱基间有一个单一性的XbaⅠ位点。
用于HsREC2在杆状病毒感染的Spodoptera frugiperda(Sf-9)昆虫细胞(ATCC细胞系No.CRL1711,Rockville MD)表达的载体pBacGSTSV，是从Dr.Zailin Yu(Baculovirus Expression Laboratory,Thomas Jefferson University)处得到。载体pVLGS的构建是通过插入一编码Schistosoma japonicum谷胱甘肽硫基转移酶多肽的片段以及一个来自pGEX-2T凝血酶裂解位点(由Smith&Johnson描述，GENE67:31(1988))被掺入载体pVL1393中，在此引入作为参考。一个多聚A末端信号序列插入pVLGS从而产生pBacGSTSV。一个包含1.2Kb hsREC2片段的质粒用KpnⅠ切，其3’非配对末端由T4聚合酶切割，而其产物由XbaⅠ切割。最终片段插入一个SmaⅠ,XbaⅠ切割的pBacGSTSV载体而产生pGST/hsREC2。
含有从pGST/hsREC2来的插入子的重组病毒经常规方法分离并感染细胞Sf-9,Sf-9细胞生长在SF900Ⅱ SFM(Gibco/BRL Cat#109020或TNM-FH(Gibco/BRL Cat#11605-011)加10％FBS。经过3～5天的培养，收集感染细胞，用不含Ca++和Mg++的PBS洗，并在5ml加了蛋白酶抑制剂(ICN Cat#158837),1％NP-40,250mM NaCl每5×107细胞数的PBS中超声处理。这些溶胞产物经3000xg离心20分钟。上清按每5×107细胞数加入0.5ml谷胱甘肽琼脂糖树脂(SigmaChem.Co.Cat#G4510)。树脂用含50mM Tris-HCl,PH8.0,150mM NaCl和2.5mM CaCl2的缓冲液洗，用凝血酶(Sigma Chem.Co.Cat#T7513)在相同的缓冲液中23℃处理使hsREC2释放。为了特定的实验，凝血酶可通过Thompson和Davie在1971年Biochim Biophys Acta250:210上发表的技术去除，即采用一个氨基已酰基对氯苯甲酰胺亲和柱(SigmaChem.Co.Cat#A9527)。
另一方面，hsREC2 cDNA全长被克隆到表达载体PacHisA上，在杆状病毒系列中过表达，并利用一个六组氨酸标记来纯化。为了克隆，hsREC2表达子被KpnⅠ切，3’突出末端被T4聚合酶切除，然后用XbaⅠ消化DNA。最终片段用SmaⅠ和XbaⅠ位点连接到PacHisA上。包含hsREC2重组病毒的纯化和昆虫细胞的感染是由the Kimmel Cancer Institute的杆状病毒表达实验室的Dr.Z.Yu完成。从2升培养基中获得的昆虫细胞球状物重悬于60ml含10mM Tris Cl,PH 7.5,130mM NaCl,2％TX-100,2μg/ml亮抑酶肽和抑肽酶以及1μg/ml抑肽素的缓冲液中，在冰上超声处理4次，每次5秒钟，每次均用微探头，并在20％的脉冲下进行(Bransonsonifier 450).碎片通过3000xg离心20分钟除掉。澄清的上清液分倒入2个50ml培养管，加入1ml Ni-NTA琼脂糖4℃条件下振荡1小时，非结合片段通过短暂离心分离出来，树脂用10ml100mM咪唑在振荡器上处理10分钟，用2000rpm离心5分钟。用500mM咪唑第二次洗10分钟后，将半流体物转移到柱子上，弃去流出液。纯化了his-hsRec2的用1M PH7.0的咪唑洗脱(收集洗脱物前咪唑放在柱子上10分钟)，用50mM Tris Cl,PH 7.4,50mM NaCl,10％甘油透析过夜。简便起见，这个蛋白被称为是hsRec2而非his-hsRec2。
6.2细菌生产重组hsREC2蛋白hsREC2 cDNA编码区通过XbaⅠ的裂解，T4聚合酶去除5’突出末端，接着用KpnⅠ的裂解而从以前采用的哺乳动物表达载体pcDNA3 G8中分离出来。最终片段被连接到一个细菌表达载体PBAD/HisC(Invitrogen.Corp.USA)的KpnⅠ和钝化的HindⅢ位点上，带有一个六组氨酰标记hREC2构建的表达载体电转入LMG194(Invitrogen.corp.USA)细菌中表达。在500ml LB氨苄青霉素培养基中接种一个单克隆并在37℃培养至对数生长期。培养物用0.02％阿拉伯糖诱导4小时，8000xg离心收集。沉淀物用1mg/ml溶菌酶重悬和溶解，并在5体积的50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1％T×100,2μg/ml亮抑酶肽和抑肽酶以及1μg/ml抑肽素，1mg/ml DNA酶，10mMβME和20mM咪唑在0℃进行超声处理。溶胞物离心10000xg30分钟来澄清，然后加入到一个封闭的含1ml活化的Ni+NTA琼脂糖树脂中，4℃振荡1小时。然后打开柱子，用20体积的含50mM NaH2PO4,300mM NaCl,1％T×100,50mM咪唑的洗脱液在4℃下靠重力洗脱。随后将结合蛋白用含500mM咪唑的3体积的上述洗脱液洗脱，并以1ml级分收集。纯化的His-HsRec2对50mM Tris,50mM NaCl,10％甘油透析过夜，储存于-80℃。
6.3 hsREC2激酶的检测磷酸酶滤膜测定。底物是肯普肽或髓鞘碱性蛋白，大约1μg his-hsRec2作为磷酸酶被加入。对这两个测定，缓冲液中包含50mM Tris Cl,PH7.5,10mM MgCl2,1mM DTT。第二个底物，32p-ATP保持在50uM比活是1972cpm/pmole和2980cpm/pmole。32p-ATP在指定时间的加入启动了在30℃发生的反应。反应结束时，取20ul点样在磷酸纤维素圆盘上，在1％磷酸中以每圆盘10ml洗两次，蒸馏水洗两次。滤膜放在Wallac Scintillation计数器中计数，没有hsRec2的底物作为对照加入并被从计数中减去以获得零点。
在上述条件下，髓鞘碱性蛋白(0.25uM)在0到25分钟之间被磷酸化。磷酸化的掺入与时间呈线性关系，在25分钟时达到1.2pmole。0到0.15mM的肯普肽被磷酸化60分钟。磷酸掺入率与底物浓度呈线性关系直至底物浓度达0.06mM，此时观察到速率为每分钟0.09pmoles。
2种不同的hsRec2缀合物，也显示磷酸酶活性。通过采用对杂交瘤上清液免疫沉淀hsRec2并随后采用下面将描述的p53作为底物来测定磷酸酶活性而获得进一步的证据说明这种活性并不是一种污染。这些实验证实该激酶活性能被抗hsRec2单克隆抗体沉淀。
没有被hsRec2磷酸化的2种底物，一个是包含一个酪氨酸的酪氨酸激酶底物多肽，从围绕着pp60src(RRLIEDAEYAARG)(SEQ ID NO.7)磷酸化位点的序列衍生。另一个是hsRec2多肽的153-172残基(VEIAESRFPRYFNTEEKLLL)(SEQ ID NO.8)。
p53磷酸化人重组p53(0.5μg,Pharmingen,San Diego,CA)与带有或不带有heRec2的含50mM Tris Cl,PH7.4,10mM MgCl2和1mM DTT缓冲液在30℃中孵育。反应通过加入32p-ATP启初(25uM ATP,40cpm/femtomole)。在每个时间点结束时加入等体积的2×电泳缓冲液(5)，并将试管放置于冰上直至所有试管都收集起来。将样品在100℃加热10分钟，用13ul走Ready Gel(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，然后转移至硝酸纤维素膜上对X光片曝光过夜。这样就能观察到放射标记的p53。
Cdc2-cyclinB磷酸激酶的测定纯化了的人重组CyclinB/cdc2(Oncogene,Cambridge,MA)采用在p53处描述过的相同缓冲条件与hsRec2在30℃中孵育10～60分钟。加入等体积的2×电泳缓冲液(5)，将样品在100℃加热10分钟，走SDS凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维素膜并进行胶片曝光。由于hsRec2激酶活性造成的放射性标记的cyclinB很容易在cyclinB由cdc2导致的“自身磷酸化”水平之上观察到。放射性标记的cdc2仅在60分钟的会hsRec2反应混合物中观察到，而在10分钟时则没有。
Cdk2/cyclinE磷酸酶的测定GST-cyclinE从pGEX-2TcycE(A.Giordano,ThomasJeffersonUniversity)转化的E.Coli中分离出来，并用谷氨酰胺葡聚糖4B(Pharmacia,Pistcataway,NJ)纯化。谷氨酰胺葡聚糖GST-cyclinE洗过后用50mM Tris Cl,PH7.4按1∶1悬浮液储存。为了测定结合上cdk2的cyclinE，将纯化的cdk2(由A.Koff,Sloan-Kettering,NY惠赠)与(6)中描述的cyclinE孵育，并通过事先清洗去掉未结合的cdk2然后以1∶1悬浮液储存。激酶测定采用在p53处描述过的相同条件，对结合或未结合cdk2的固定化的GST-cyclinE进行的。在没有cdk2时，cyclinE和hsREC2的磷酸化很容易观察到。cdk2存在时，能见到自身磷酸化。然而，cyclinE的hsREC2磷酸化在此水平上也很明显。
p53与hsRec2的体外结合hsRec2(5μg)和15ul琼脂糖-GST-p53(Oncogene Sciences)加入到含以下成分10％甘油，50mM Tris Cl,PH7.4,0.1mM EDTA,1mMDTT,0.02％NP40,200mM NaCl,10μg/ml抑肽酶和亮抑酶肽以及20um PMSF的0.5ml结合缓冲液中。室温一个小时后，p53琼脂糖沉淀下来，并用较高浓度离子去垢剂(0.1％NP40)的上述缓冲液洗2次，然后用50mM TrisCl,PH7.4,10mM MgCl2洗一次。
体外翻译的hsRec2与PCNA,p53和cdc2的结合首先采用1μg载体，在体外转录(Ambion,Austin TX)XbaⅠ线性化的PCMVhREC2，然后以含有Xef1 mRNA作为负对照的试剂盒在体外被翻译。用35S-甲硫氨酸标志的包含有Xef1或hsREC2的翻译产物的网织红细胞溶胞产物与HCT116细胞中得到的1.2mg细胞提取物(抽提液含50mM Tris Cl,pH7.4,120mM NaCl,0.5％NP40,20uM PMSF,2μg/ml抑肽素，10μg/ml抑肽酶和亮抑酶肽，MB))孵育2小时，随后加入抗PCNA,p53或cdc2的抗体10μg孵育过夜。第二天，加入蛋白质A葡聚糖处理2小时，然后用500ul MB洗得到的沉淀4次。沉淀悬浮于40ul样品缓冲液中，煮沸10分钟，取15ul走10％凝胶电泳，然后在对X-光片曝光前转移到硝酸纤维素膜上以取得较低的背景。
序列一览表<110>Thomas Jefferson UniversityCornell Research FoundationKimeragen,Inc.<120>REC2激酶<130>8321-70 PC<140><141><150>09/157,603<151>1998-09-21<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>350<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Gly Ser Lys Lys Leu Lys Arg Val Gly Leu Ser Gln Glu Leu Cys1 5 10 15Asp Arg Leu Ser Arg His Gln Ile Leu Thr Cys Gln Asp Phe Leu Cys20 25 30Leu Ser Pro Leu Glu Leu Met Lys Val Thr Gly Leu Ser Tyr Arg Gly35 40 45Val His Glu Leu Leu Cys Met Val Ser Arg Ala Cys Ala Pro Lys Met50 55 60Gln Thr Ala Tyr Gly Ile Lys Ala Gln Arg Ser Ala Asp Phe Ser Pro65 70 75 80Ala Phe Leu Ser Thr Thr Leu Ser Ala Leu Asp Glu Ala Leu His Gly85 90 95Gly Val Ala Cys Gly Ser Leu Thr Glu Ile Thr Gly Pro Pro Gly Cys100 105 110Gly Lys Thr Gln Phe Cys Ile Met Met Ser Ile Leu Ala Thr Leu Pro
115 120 125Thr Asn Met Gly Gly Leu Glu Gly Ala Val Val Tyr Ile Asp Thr Glu130 135 140Ser Ala Phe Ser Ala Glu Arg Leu Val Glu Ile Ala Glu Ser Arg Phe145 150 155 160Pro Arg Tyr Phe Asn Thr Glu Glu Lys Leu Leu Leu Thr Ser Ser Lys165 170 175Val His Leu Tyr Arg Glu Leu Thr Cys Asp Glu Val Leu Gln Arg Ile180 185 190Glu Ser Leu Glu Glu Glu Ile Ile Ser Lys Gly Ile Lys Leu Val Ile195 200 205Leu Asp Ser Val Ala Ser Val Val Arg Lys Glu Phe Asp Ala Gln Leu210 215 220Gln Gly Asn Leu Lys Glu Arg Asn Lys Phe Leu Ala Arg Glu Ala Ser225 230 235 240Ser Leu Lys Tyr Leu Ala Glu Glu Phe Ser Ile Pro Val Ile Leu Thr245 250 255Asn Gln Ile Thr Thr His Leu Ser Gly Ala Leu Ala Ser Gln Ala Asp260 265 270Leu Val Ser Pro Ala Asp Asp Leu Ser Leu Ser Glu Gly Thr Ser Gly275 280 285Ser Ser Cys Val Ile Ala Ala Leu Gly Ash Thr Trp Ser His Ser Val290 295 300Asn Thr Arg Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Asp Ser Glu Arg Arg Gln Ile305 310 315 320Leu Ile Ala Lys Ser Pro Leu Ala Pro Phe Thr Ser Phe Val Tyr Thr325 330 335Ile Lys Glu Glu Gly Leu Val Leu Gln Ala Tyr Gly Ash Ser340 345 350<210>2<211>1797<212>DNA<213>人<400>2cggacgcgtg ggcgcgggga aactgtgtaa agggtgggga aacttgaaag ttggatgctg 60cagacccggc atgggtagca agaaactaaa acgagtgggt ttatcacaag agctgtgtga 120ccgtctgagt agacatcaga tccttacctg tcaggacttt ttatgtcttt ccccactgga 180gcttatgaag gtgactggtc tgagttatcg aggtgtccat gaacttctat gtatggtcag 240cagggcctgt gccccaaaga tgcaaacggc ttatgggata aaagcacaaa ggtctgctga 300tttctcacca gcattcttat ctactaccct ttctgctttg gacgaagccc tgcatggtgg 360tgtggcttgt ggatccctca cagagattac aggtccacca ggttgtggaa aaactcagtt 420ttgtataatg atgagcattt tggctacatt acccaccaac atgggaggat tagaaggagc 480tgtggtgtac attgacacag agtctgcatt tagtgctgaa agactggttg aaatagcaga 540atcccgtttt cccagatatt ttaacactga agaaaagtta cttttgacaa gtagtaaagt 600tcatctttat cgggaactca cctgtgatga agttctacaa aggattgaat ctttggaaga 660agaaattatc tcaaaaggaa ttaaacttgt gattcttgac tctgttgctt ctgtggtcag 720aaaggagttt gatgcacaac ttcaaggcaa tctcaaagaa agaaacaagt tcttggcaag 780agaggcatcc 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Arg165 170 175Val His Leu Cys Arg Glu Leu Thr Cys Glu Gly Leu Leu Gln Arg Leu180 185 190Glu Ser Leu Glu Glu Glu Ile Ile Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ile195 200 205Val Asp Ser Ile Ala Ser Val Val Arg Lys Glu Phe Asp Pro Lys Leu210 215 220Gln Gly Asn Ile Lys Glu Arg Asn Lys Phe Leu Gly Lys Gly Ala Ser225 230 235 240Leu Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Glu Phe Ser Ile Pro Val Ile Leu Thr245 250 255Asn Gln Ile Thr Thr His Leu Ser Gly Ala Leu Pro Ser Gln Ala Asp260 265 270Leu Val Ser Pro Ala Asp Asp Leu Ser Leu Ser Glu Gly Thr Ser Gly275 280 285Ser Ser Cys Leu Val Ala Ala Leu Gly Asn Thr Trp Gly His Cys Val290 295 300Asn Thr Arg Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Asp Ser Glu Arg Arg Gln Ile305 310 315 320Leu Ile Ala Lys Ser Pro Leu Ala Ala Phe Thr Ser Phe Val Tyr Thr325 330 335Ile Lys Gly Glu Gly Leu Val Leu Gln Gly His Glu Arg Pro340 345 350<210>4<211>1525<212>DNA<213>肌肉<400>4gggagccctg gaaacatgag cagcaagaaa ctaagacgag tgggtttatc tccagagctg 60tgtgaccgtt taagcagata cctgattgtt aactgtcagc actttttaag tctctcccca 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tgccaagtct cctctggctg ccttcacctc ctttgtctac 1020accatcaagg gggaaggcct ggttcttcaa ggccacgaaa gaccataggg atactgtgac 1080ctttgtctag tgctgattgc atgtgactca tgaaatgaaa caggactgcg ctgcttggaa 1140aaaggaaacg gaagccaaca taatgaggat taattggttg gttgctgttg aggtggtaac 1200agtgatttca gacccggaag gtgaagatga agaagccttt atccagtctc tggatgcaga 1260ggctaggggc tccaccaccg tgggatgtca gcggccatcg taataatttg cacttacaca 1320agcacctttc agccatgccc ctcaaagtgg ttcagccaca ttaattaatt aaagcccaca 1380atccccctag ggagagcagg agggggacta acaagatttg taattacaga agggaaaatt 1440tccgaataaa gtattgttcc gccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1525<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述丝/苏氨酸激酶的底物<400>5Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly1 5<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>6gagctcgagg gtacccatgg gtagcaagaa ac 32<210>7<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述天然产生的蛋白质的片段<400>7Arg Arg Leu Ile Glu Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述天然产生的蛋白质的片段<400>8Val Glu Ile Ala Glu Ser Arg Phe Pro Arg Tyr Phe Asn Thr Glu Glu1 5 10 15Lys Leu Leu Leu20
权利要求
1．一种磷酸化含丝氨酸底物的方法，包括将底物与有效浓度ATP和一个具有包含Rec2激酶或哺乳动物Rec2序列的序列的酶，一起孵育，以及测量底物磷酸化的数量。
2．权利要求1中的方法，其中酶的序列包括含有不同于Tyr163的序列的Rec2激酶的序列。
3．权利要求2中的方法，其中酶的序列包括含有不同于Tyr163的序列的hsRec2激酶的序列。
4．权利要求3中的方法，其中的底物从人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE组成的底物组中选择。
5．权利要求3中的方法，其中的底物是肯普肽。
6．权利要求1中的方法，其中酶的序列包括hsRec2的序列。
7．权利要求6中的方法，其中的底物从人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE组成的底物组中选择。
8．权利要求6中的方法，其中的底物是肯普肽。
9．权利要求1中的方法，其中酶的序列包括哺乳动物Rec2的序列。
10．权利要求9中的方法，其中的底物从人蛋白p53,cdc2,cdk2和cyclinE组成的底物组中选择。
11．权利要求9中的方法，其中的底物是肯普肽。
12．权利要求1中的方法，进一步包含酶与酶的激动剂或拮抗剂形成混合物的步骤以及测定所述的拮抗剂或激动剂对底物磷酸化数量的影响。
13．组合物，它包含a．序列中具有包含Rec2激酶或哺乳动物Rec2序列的酶；b．酶的包含丝氨酸的底物；c．γ-磷酸标记的ATP。
14．权利要求13中的组合物，其中标记的磷酸根是32P。
15．权利要求13中的组合物，其中底物是一个细胞周期调控蛋白。
16．权利要求15中的组合物，其中底物是从人p53,cdc2,cdk2和cyclinE组成的底物组中选择。
17．权利要求13中的组合物，其中的底物是肯普肽。
18．权利要求13中的组合物，其中酶的序列包括hsRec2或hsRec2Ala163。
19．包含其序列具有不同于Tyr163氨基酸的Rec2激酶的酶。
20．一种酶，具有的序列包含不同于Tyr163的氨基酸的哺乳动物Rec2序列。
全文摘要
本发明包括通过将底物与ATP和由hsRec2或muRec2以及其衍生物所产生的酶共同孵育来进行底物丝氨酸磷酸化的方法。Rec2激酶活性的天然底物是细胞周期调控蛋白,例如p53和cyclinE。Rec2的过表达已知能使细胞周期阻断和凋亡,本发明公开这些影响是激酶介导的。相应地,本发明提供了评定Rec2激动剂或拮抗剂的方法,这些激动剂或拮抗剂具有药理活性。本发明还公开了hsRec2与至少三个细胞周期调控蛋白:p53,PCNA和cdc2之间存在特异的结合。
文档编号G01N33/566GK1319132SQ99811166
公开日2001年10月24日 申请日期1999年9月17日 优先权日1998年9月21日
发明者P·A·哈夫雷, M·C·赖斯, W·K·霍洛曼, E·B·克米克 申请人:托马斯杰弗逊大学, 康乃尔研究基金会有限公司, 瓦利根美国有限公司