专利名称：高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高活性果糖缬氨酸氧化酶，本发明也同时涉及一种高活性果糖缬 氨酸氧化酶的制备方法。
背景技术：
血液中的糖化血红蛋白(以下简称糖化Hb)反映了一段时期内生物体内的血 糖水平，近年来被用作糖尿病的诊断和治疗的重要指标。目前，糖化Hb可采用高效 液相色谱法、微柱法、免疫法、色素法等方法来测定，但这些方法或者需要专用仪器、 价格昂贵，或者检测时间长、测量精度差，最近流行的酶法检测，利用氧化还原反应， 不需要特殊的测定仪器，操作简便易行，精度高，时间短，因此广泛应用于生化分析 和临床检査。
利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定过程中，需要一类特殊的酶类——果糖 基氨基酸氧化酶，该酶可作用于糖化Hb或糖化氨基酸，产生过氧化氢，然后添加过 氧化物酶和还原剂，使过氧化氢和还原剂之间发生氧化还原反应，可通过测定还原剂 的显色来测定过氧化氢量，从而可知样品中糖化Hb含量。
然而，利用现有果糖基氨基酸氧化酶催化该反应，时间仍嫌稍长，酶量需求较高。 所以要求开发新型高活性果糖基氨基酸氧化酶。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性 6倍的高活性果糖缬氨酸氧化酶，其可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反 应时间縮短。
本发明的另一目的在于提供一种高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法。 本发明基于果糖缬氨酸氧化酶的编码序列，通过易错PCR技术，建立了果糖缬 氨酸氧化酶的突变文库，将突变文库转入大肠杆菌，进行两轮筛选，得到了活性约为 普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的新型高活性果糖缬氨酸氧化酶。该高活性果糖纈氨 酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQID.No.2的序列。
本发明的一种编码高活性果糖缬氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID. No. 1所示序列。
本发明的高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法步骤如下
(1) 以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR 扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；
(2) 将突变文库转入大肠杆菌，对'其基因进行克隆、重组转化和表达；
(3) 利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确
性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性 差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。为此，人们利用酶的定 向进化技术对天然酶进行改造，从而获得预先期望的具有某些特性的进化酶。
定向进化包括随机突变和筛选，其中随机突变应用较为普遍的技术是易错PCR 突变，即通过调整PCR体系中的离子浓度，各种dNTP含量，引物和模板浓度，使用 易产生突变的Taq酶，使用突变率高的菌株等方法，使PCR产物相对于模板产生许 多点突变，从而改变蛋白的氨基酸序列。*通过条件筛选，获得具有期望特性的目的酶。
棒状杆菌属Corynebacterium sp. 2-4-1菌株含有果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)的编 码基因。本发明基于FVO的基因编码序列，设计两条FVO基因的易错PCR引物， 上游引物序列为5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列 为5'-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因编码序列作 为模板，进行易错PCR扩增，经扩增35个循环后，PCR产物纯化回收，与原核表达 载体pMD-l8 T Vector连接，转化入大肠杆菌XLl-Red中，涂布LB平板，收集含有 插入片段的克隆，组成突变体库。
提取突变体库中的质粒DNA，酶切，回收目的片段，连接入载体pGEX-4T-lm，转 化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果.糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲 基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板，由于大肠杆菌自身含有过氧化物酶，故37'C培养 12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变g快和变色圈大的克隆进行液体培养基培 养。
将初步筛选出的克隆在25'C液体培养基中培养48小时，诱导表达，裂解细菌， 利用醌法测定酶活性，最终得到一株酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的高
活性菌株，其所携带的FVO突变命名为FV0-m-21。通过测序分析发现，该突变克隆中 发生五个碱基点突变，分别是碱基序列中57位C—T、 374位T—C、 534位G—A、 914 位C—A和1056位G—C，共引起了两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位Ile —Thr和305位Ala—Glu。将FVO-m-21大量培养，诱导表达后纯化分离目的酶，用 于糖化Hb蛋白的检测，可得到较好效果。
本发明的果糖缬氨酸氧化酶，活性高，约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍，其 可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反应时间縮短，适合于试剂盒的制备和 应用，可广泛应用于临床检测。而且，制备方法都是采用现有常规手段，易于实施。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不仅限于下述实施例。 实施例1
以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增。
1. 引物序列
正向弓I物 5 ，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3' 反向引物 5'陽TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3 ，
2. 易错PCR反应体系和反应条件
PCR反应体系 100nL体系中含有
10 mM Tris-HClpH 8.30， 50 mM KC1， 6.5 mM MgCl2， 0.15 mM MnCl2， 0,2 mM dGTP/dATP， 0.8 mM dTTP/dCTP， 2.2 pg SSB Protein, 0.5正向/反向引物，10 ng模板DNA 2.5单位TaqDNA聚合酶。 PCR反应条件
94 。C 5 min; 94 °C 30 see, 55 。C 30 sec， 72 °C 2 min, 35个循环；72 °C 10 min; 4 。C forever 。
3. 易错PCR产物取3 nL于P/。的琼脂糖凝胶电泳，可见l kb左右有产物条带。将 易错PCR产物用纯化回收试剂盒纯化回收，与pMD-18TVector连接，转化入大肠杆 菌XL 1-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可获得Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基 因的突变体库。 实施例2:
突变体菌株的初筛
提取突变体库中的质粒DNA，用BamHI和Hind III双酶切，回收lkb左右的目 的片段，载体pGEX-4T-lm同样用BamH I和Hind III双酶切，回收，二者4'C连接过 夜，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和1^-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板；37'C培养12-24小时后，可见明显变色现 象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养，共挑取克隆48个。
实施例3:
突变体酶活性的醌法检测
1. 在诱导表达4小时后，收集菌液，测量并且记录细胞培养物的OD600值。
2. 制备检测酶活的细菌裂解液。在374hLB-PERtm细菌蛋白抽提试剂(Pierce product 78248)中重新悬浮细胞，再加入50uL蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物
(Sigma产品P8465), 1 uL 34 mg/mL的氯霉素(用甲醇配制)。快速涡旋振荡一分 钟。在冰上放置5 min。离心1 min后置于冰上。
3. 用Bradford法测定蛋白含量。
4. 取50pL上述细菌裂解液加到醌法反应混合液中，37'C温浴1-3 min，测量555 nm 处吸光值。反应混合液成分为100 mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0), 1 purpurogallin unit/ml 过氧化物酶，0.45 mM 4-氨基安替吡啉，0.5mMTOOS (N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基) -3-甲基苯胺)，5.0mM果糖缬氨酸，总体积为3mL。
其中， 一个酶活力单位定义为在37'C每分钟可催化产生0.5pM醌染料。实际酶活力 按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。
实施例4:
高活性突变FVO的序列测定
通过酶活力测定，筛选出活力约为普通果糖缬氨酸氧化酶活力6倍的高活突变。 提取质粒DNA，测序发现该突变序列如SEQ ID. No. 1所示。
其中发生突变的位点，为57位C—T、 374位T—C、 534位G—A、 914位C—A 和1056位G—C。
对应的氨基酸序列如SEQ ID. No. 2所示。
其中发生突变的氨基酸位点，共有两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位 lie—Thr和305位Ala—Glu。
以上实施例是对专利的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的 精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING <110>宁波美康生物科技有限公司 <120>高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法 <130> 001 <160〉 2
< 170> Patentln version 3.3
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<211> 1119
<212> DNA
<213> Corynebacterium sp. <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1119)
<400> 1
atg tec tec acc get acc aag cat gtc gcc gtc att ggc ggc ggc ate 48 Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val lie Gly Gly Gly lie 15 10 15
ctg ggc gtt tec acc gcc gtc cac ctg etc cgc caa ggc gca aca gtc 96 Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gin Gly Ala Thr Val 20 25 30acc etc ttg acc gaa cag ggc etc gcc age gaa gcc acg ggc egg tec 144 Thr Leu Leu Thr Glu Gin Gly Leu Ala'Ser Glu Ala Thr Gly Arg Ser 35 40 45
ttg tec tgg etc aac tec gcc ggg gaa cgc tec act ccc tat cac cag 192 Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Thr Pro Tyr His Gin 50 55 60
ctg cgc ate get ggc gtt gac egg tac cgc acg ctg ttc gcc gcc gat 240
Leu Arg He Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr Leu Phe Ala Ala Asp
65 70 75 80
ccc age egg gaa tgg ttg cag ttc ggg ggc ggg etc atg tgg aac gcc 288 Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gin Phe Gly Gly Gly Leu Met Trp Asn Ala
85 卯 95
gcc ggg gaa agt gag gtc acc aaa gcc egg cac gcc tac gag aag tec 336 Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser 100 105 110
ate ggc tac gac tec caa ctg ctg gcc cct gaa gaa acc ggc teg gtc 384 lie Gly Tyr Asp Ser Gin Leu Leu Ala fro Glu Glu Thr Gly Ser Val 115 120 125
acg cca ggc ate gac gcc agt gcc gtc ccg gag aac gca ate ttc aat 432 Thr Pro Gly lie Asp Ala Ser Ala Val Pro Glu Asn Ala lie Phe Asn 130 135 140
cct ggc gag ggc tgg gtc age ctg ccg gac ctg gtg aac ttc ctg atg 480
Pro Gly Glu Gly Trp Val Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met
145 150 155 160gag gaa ttc cac gcc ctg ggc ggc cag ttg gtc etc aac gca ggt aaa 528 Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gin.Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys
165 170 175
gcc tea gtg atg gtc gag ggc ggc egg get acc gcg gtc gaa acc gcc 576 Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Ala Val Glu Thr Ala 180 185 l卯
acc ggt gaa acc tac ccc gcg gac gcc gtt etc gta gcc tgc ggt gcc 624 Thr Gly Glu Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala 195 200 205
gcg acg ccg gcc gtc gta aaa ccg etc ggg gtc gag ata ccg aac ggt 672 Ala Thr Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu lie Pro Asn Gly 210 215 220
tec ccg gtc tec atg ctg gtt gtt acc aag ccc gtg gag cac cag gtc 720
Ser Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gin Val
225 230 235 240
gcg gca gtg atg aat acg ccg cgc get gcc gtg cga ccc aat ccg ggt 768 Ala Ala Val Met Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro Gly
245 250 255
aac act ttt gcc ttg gat cac gac tgg tat gaa ggg cac ate act gag 816 Asn Thr Phe Ala Leu Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His lie Thr Glu 260 265 270
cac gcg gac ggt teg ttc acc ate ccg gat gat gtc gtc cag gaa ttg 864 His Ala Asp Gly Ser Phe Thr lie Pro Asp Asp Val Val Gin Glu Leu
275 280 285
gca gac gag tea tec aag ctg ate gca gga aac ccc gag etc aag ccg 912 Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu lie Ala Gly Asn Pro Glu Leu Lys Pro 290 295 300
gaa tcg tgg aag ate ggt tac aag ccg ate ccg ggc gac ggc gaa cca 960
Glu Ser Trp Lys lie Gly Tyr Lys Pro lie Pro Gly Asp Gly Glu Pro
305 310 315 320
gtc ttc ggg gaa etc ggc cga gta ccg ggc tgc ttc gtg get ttc acc 1008 Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly Cys Phe Val Ala Phe Thr
325 330 335
cac tea ggt gcc acc ctg ggc etc ate gca ggc gaa ttg etc tec ggc 1056 His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu lie Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly 340 345 350
cag ate ctg acg ggg gac aag cac ccc atg ttc gcc acg ttc egg ccg 1104 Gin lie Leu Thr Gly Asp Lys His Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro 355 360 365
ggc egg ttc tec tag 1119 Gly Arg Phe Ser 370
<210> 2
<211> 372
<212> PRT
<213> Corynebacterium sp.
<400> 2
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GlyArgPheSer 370
权利要求
1.一种高活性果糖缬氨酸氧化酶，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID.No.2的序列。
2、 一种编码权利要求1所述的高活性果糖缬氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸 序列为SEQ ID. No. 1所示序列。
3、 一种高活性果糖缬氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于其步骤如下(1) 以Corynebacterium sp. 2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR 扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；(2) 将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；(3) 利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。
全文摘要
本发明涉及一种高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法，其氨基酸序列为SEQ ID.No.2的序列；核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示序列。制备步骤为(1)以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；(2)将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；(3)利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。所得果糖缬氨酸氧化酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性的6倍，其可用于糖化Hb试剂盒检测，所用酶量减少，反应时间缩短。
文档编号C12N9/02GK101368174SQ200810166340
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月23日 优先权日2008年9月23日
发明者姜云飞, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技有限公司