专利名称：酶制备富集对映体的β－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及制备富集对映体的β-氨基酸的方法。本发明还涉及有益的β-氨基酸酯以及它们在酶制备富集对映异构体的β-氨基酸的方法中的用途。
作为β-氨基羧酸的制备方法，迄今已经建立了经由非对映异构盐的常规外消旋体拆分方法(建议路线H.Boesch et al.，Org.Proc.Res.Developm.2001，5，23-27)，特别是苯乙基酰胺锂的非对映选择性加成的拆分方法(A.F.Abdel-Mafid，J.H.Cohen，C.A.Maryanoff，Curr.Med.Chem.1999，6，955-970)。尽管会带来许多不利，但是后者方法已经被集中研究并且优选使用。一方面，需要化学计量量的手性试剂，与催化不对称方法相比这是主要的缺点。此外，需要昂贵且危险的辅助物质如正丁基锂来通过去质子化而活化化学计量试剂。另外，为了得到满意的立体选择性，在约-70℃的低温进行反应是重要的，这意味着对反应器材料、附加成本及高能量消耗的高要求。
尽管通过生物催化方式制备光学活性的β-氨基羧酸在目前仅处于次要的地位，但是从生物催化反应的经济和生态学优点考虑，它是特别希望的。不需要使用化学计量量的手性试剂，只需要使用很少的催化量的酶，酶是对自然和环境友好的催化剂。与大量合成的含金属催化剂相比，除了它们的催化特性和高活性外，这些在水介质中高效使用的生物催化剂具有可能不需要使用含金属、尤其是含重金属并因此是有毒物质的优点。
例如，在现有技术中，对映选择性的β-氨基羧酸的N-酰化已经被报道多次。
例如，于TetrahedronAsymmetry，Vol.7，No.6，p.1707-1716，1996，L.T.Kanerva等人描述了不同脂环族β-氨基羧酸乙酯在有机溶剂中使用2，2，2-三氟乙酯和来自Candida antarctica的脂肪酶SP 526或者来自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS作为生物催化剂的对映选择性N-酰化。
V.M.Sanchez等研究了使用来自Candida antarctica的脂肪酶经由N-酰化β-氨基羧酸酯制备的(±)-乙基-3-氨基丁酸酯的生物催化外消旋体拆分(TetrahedronAsymmetry，Vol.8，No.1，p.37-40)。
EP-A-8 890 649公开了在水解酶存在下通过羧酸酯的对映选择性酰化从外消旋氨基酸酯中制备光学活性氨基酸酯，以及接着分离未转换氨基酸酯对映体的方法，其中水解酶选自酰胺酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶。
WO-A-98/50575报道了为了立体选择性地酰化外消旋β-氨基羧酸的对映体，使酰基给体外消旋β-氨基羧酸与青霉素G酰基转移酶在一定条件下接触，从而获得手性β-氨基羧酸及其相应酯的方法，其中其它的对映体基本上未转化，因此获得手性的β-氨基羧酸。
也已经研究了相反的反应顺序(V.A.Soloshonok，V.K.Svedas，V.P.Kukhar，A.G.Kirilenko，A.V.Rybakova，V.A.Solodenko，N.A.Fokina，O.V.Kogut，I.Y.Galaev，E.V.Kozlova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，Synlett 1993，339-341；V.Soloshonok，A.G.Kirilenko，N.A.Fokina，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，V.P.Kukhar，V.K.Svedas，E.V.Kozlova，TetrahedronAsymmetry，1994，5，1119-1126；V.Soloshonok，N.A.Fokina，A.V.Rybakova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，A.E.Sochorinsky，V.P.Kukhar，M.V.Savchenko，V.K.Svedas，TetrahedronAsymmetry，1995，6，1601-1610；G.Cardillo，A.Tolomelli，C.Tomasini，Eur.J.Org.Chem.1999，155-161)。该方法的缺点是产物混合物很难进行随后的对映选择性水解。分离游离β-氨基羧酸后，获得很难分离的苯乙酸和N-苯乙酰基-β-氨基羧酸的混合物。
为了得到富集对映体的羧酸，很久前就已知将它们与脂肪酶反应。在US 5518903中，该原理已经被转化为N-保护的β-氨基酸酯，但是却有不同的成功程度。当只有外消旋N-丁氧基羰基-β-氨基丁酸的相应苄基酯可以通过脂肪酶以高度对映选择性方式拆分时，残留的所用甲基酯和正丁基酯仅实现ee值在70％附近。需要注意的是从相应甲基酯到正丁基酯的转变明显伴随着所制备酸ee值的降低。例如，用得自Asahi的脂肪酶从N-Boc-β-氨基丁酸起始的酯水解在8天后以37％的产率给出相应酸的ee值为45％ee。使用得自Amano的脂肪酶PS时，相同反应在7天内以41％的产率可以获得富集到61％ee的化合物。相比而言，相应的甲基酯为70％ee。
最近Faulconbridge等报道的结果表明用Amano的脂肪酶PS在pH 8时发生芳香β-氨基酸乙酯的酯水解，带有可接受的产率和非常好的对映体过量(Tetrahedron Letters 2000，41，2679-81)。获得产品的对映体纯度高达99％，但是该合成仅仅在悬浮液中进行，有一些缺点。一方面，已经发现尽管在这些条件下结晶是选择性的，但是如比较例1中所述，反应本身导致了较低的ee值为85.1％ee。总之，这意味着一方面由于形成不希望的对映体而造成产率的损失，另一方面由于改变的结晶条件，与轻微的方法变化有关的ee值可能容易地降到99％ee以下，或者甚至降到商业规模的98％ee以下。但是，药物应用需要尽可能高的ee值，＞98％ee，尤其是＞99％ee。另外，为了能确保良好的酶超滤分离，在均相介质(没有悬浮物)中进行反应也是希望的。最优地，在此种步骤下还获得高的ee值，这并不能由迄今为止已知的文献方法所实现。
从先前的技术中并没有更详细地提及、但是可以很明显地看出的这种或其它的目标，可以根据本发明的要点通过具有权利要求1特征的方法而实现。从属权利要求2到8涉及本发明优选的实施方案。权利要求9涉及新型的β-氨基酸酯，以及在权利要求10中保护其在本发明方法中的有益用途。
因为通过使用水解酶对N-未保护β-氨基酸酯对映体混合物的酶水解来制备富集对映异构体的N-未保护β-氨基酸的方法是在不使用相应甲基或乙基酯的条件下进行的，所以本发明设定的目标以非常令人惊奇、但没有不利因素的方式实现。迄今，只有N-未保护β-氨基酸的甲基或乙基酯被用于所讨论的反应，但是这些酯具有上述的缺点。当体积大的酯基团，例如(C3-C8)-烷基基团被用于酶水解时，可以明显得到以空间/时间效率和选择性表示的更好的结果。参照上述的US 5518903(sic)，这一方面被认为是令人惊奇的，另一方面其趋势是意想不到的，因为随着更快的反应，对映分化的概率一般降低。例如，如果认为在更高的反应温度下，因此反应进行得更快，而具有一般更低的对映选择性，则可以说明这种逻辑关系。
原则上，本领域技术人员可随意选择酯基团。当在做这种选择时，应该由经济和考虑相关反应所指导。用于形成酯的有利的醇尤其是那些容易从反应混合物中除去的醇。例如这些醇可以是烷基醇或芳基醇，任选低沸点酚或苄基醇。因此优选在水解中使用由那些醇获得的β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。特别优选使用β-氨基酸的相应正丙酯、异丙酯、正丁酯、仲丁酯、异丁酯或叔丁酯。
本领域技术人员还可随意选择反应参数。这些参数将由常规实验对每种情况单独确定。在任何情况下，对于本发明主题的酶方法而言，适当的pH范围4到10，优选6到9，而且最优选7到8.5。已经证明Amano的脂肪酶PS在约pH8时是特别适合的。
关于温度，要求原则上与pH值相同。在本发明中，最优的温度可以对每种情况根据酶工作的最佳温度来确定。对于来自喜温有机体的酶，可能达到100℃以上的高温。其它的酶最优仅在＜0℃到-15℃下工作，任选在冰基质中工作。反应期间设定的温度应该优选在15到40℃的范围内，更优选地从20到30℃。
本领域技术人员负责选择所用的酶。许多适当的酶可以从Enzyme Catalysis in Organic Synthesis，Ed.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，p.165及其引用的文献中选择。对于酯的水解，优选使用脂肪酶，更优选使用来自Pseudomonas cepacia的Amano的脂肪酶PS。
所述的多肽可以以均匀纯化化合物的游离态使用，或者以通过重组方法制备的酶的形式使用。多肽还可以作为完整主体有机体的部分使用，或者与分解并且按要求高度纯化的主体有机体的细胞团块结合使用。
还可以使用固定形式的酶(Sharma B.P.；Bailey L.F.and MessingR.A.(1982)，Immobilisierte Biomaterialien-Techniken undAngwendungen，Angew.Chem.94，836-852)。可优选通过冷冻干燥进行固定(Paradkar，V.M.；Dordick，J.S.(1994)，Aqueous-Like Activity ofα-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhtdrous Organic Solvents，J.Am.Chem.Soc.116，5009-5010；Moiri，T.；Okahata，Y.(1997)，A varietyof lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalystsin homogenous organic solvents，Tetrahedron Lett.38，1971-1974；Otamiti，M.；Adlercreutz，P.；Matthiasson，B.(1992)，Complex formationbetween chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize theenzyme in active form in toluene，Biocatalysis 6，291-305)。特别优选在表面活性剂存在下的冷冻干燥，表面活性剂例如气溶胶OT、或聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇(PEG)或Brij 52(二乙二醇一十六烷基酯)(Kamiya，N.；Okazaki，S.-Y.；Goto，M.(1997)，Surfactant-horseradishperoxidase complex catalytically active in anhydrous benzene，Biotechnol.Tech.11，375-378)。
最优选地是在Eupergit上、尤其是在Eupergit和Eupergit250L(Roehm)上固定(概略地参见E.Katchalski-Katzir，D.M.Kraemer，J.Mol.Catal.BEnzym.2000，10，157)。在Ni-NTA上通过与附着His标记(六组氨酸)改性的多肽结合来固定也是优选的(Petty，K.J.(1996)，Metal-chelate affinity chromatography inAusubel，F.M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，New York；JohnWiley and Sons)。
还可以以CLECs的形式使用(St.Clair，N.；Wang，Y.-F.；Margolin，A.L.(2000)，Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC)ofalcohol dehydrogenase，Angew.Chem.Int.Ed.39，380-383)。
通过这些措施，还可能从由于有机溶剂而变得不稳定的多肽中产生能够在含水和有机溶剂混合物中或者在全部有机介质中工作的多肽。
本发明主题反应可以在为此提供的任何容器中进行。这些反应容器详细而言为常规间歇式反应器、环管反应器或酶-膜反应器(Bommarius，A.S.；Drauz，K.；Groeger，U.；Wandrey，C.；MembraneBioreactors for the Production of Enantiomerically Pure a-AminoAcids，inChirality in Industry(eds.；Collins，A.N.；Sheldrake，G.N.；Crosby，J.)1992，John Wiley and Sons，p.371-397)。
本发明反应中使用的酯有时在水相反应介质中表现出不好的溶解性。在这些情况下，为了获得均匀的反应相，向反应混合物中加入水溶性有机溶剂是有利的，这取决于所用酶的溶剂承受能力。适当的水溶性有机溶剂特别是丙酮、DMF、乙醇、甲醇。
在使用任选吸附在水不可溶载体材料或者补充物质或稳定剂上的酶的情况下，已经证明假定酶和载体的分离可以以简单的方式进行，那么在反应中使用酶之前，分离不可溶载体或者补充物质或稳定剂是有利的，以便由所用酶的不可溶载体材料所沉淀的产品不受污染。例如，有利使用的Amano脂肪酶PS被吸附在二氧化硅载体上。在向反应介质中加入反应物前，为了从反应系统中除去二氧化硅，应该过滤酶的水溶液。此程序并不会不利地影响酶的活性或者方法的稳定性。
本发明还提供具有下面结构(I)的β-氨基酸正丙酮酯 其中，R代表(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-环烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-杂芳基、(C4-C19)-杂芳烷基、((C1-C8-烷基)1-3-(C3-C8)-环烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-杂芳基；R’代表H、(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-环烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-杂芳基、(C4-C19)-杂芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-环烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-杂芳基。
特别有利的化合物是以下化合物其中R代表芳基，尤其是苯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基，以及它们在芳环上的单或多取代衍生物，尤其是用(C1-C8)-烷基或者(C1-C8)-烷氧基作为取代基，并且其中R’代表H。
3-氨基-3-苯基丙酸正丙醇酯可以作为这类特别令人有兴趣的化合物的代表性实例提及。
本发明还涉及上述化合物在本发明方法中的用途。
在本发明的范围内，“N-未保护”被理解成指酸的β-氮原子没有被反应条件下稳定的N-保护基团所保护。这些保护基团尤其被认为是通常的保护基团，例如Z、Boc、Fmoc、Eoc、Moc、乙酰基等。
(C1-C8)-烷基被认为是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，包括双键不同位置的所有异构体。它们可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基单取代或多取代。(C3-C8)-烷基也可以这么认为。
(C2-C8)-烯基被理解成是除甲基外，含有至少一个双键的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C2-C8)-炔基被理解成是除甲基外，至少含有一个三键的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-酰基被理解成是经由-C＝O-官能团与分子结合的(C1-C8)-烷基。
(C3-C8)-环烷基被理解成是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或环庚基等。它们可以被一个或多个卤素原子和/或含N、O、P、S原子的基团所取代、和/或具有含有N、O、P、S原子的环基团，例如1-，2-，3-，4-哌啶基、1-，2-，3-吡咯烷基、2-，3-四氢呋喃基、2-，3-，4-吗啉基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C6-C18)-芳基被理解成是含有6到18个碳原子的芳基基团。特别地，它们包括苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C7-C19)-芳烷基是经由(C1-C8)-烷基与分子结合的(C6-C18)-芳基。
(C1-C8)-烷氧基是经由氧原子与所述分子键合的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-烷氧羰基是经由-OC(O)-官能团与所述分子结合的(C1-C8)-烷基。相同地描述类似地应用于其它的氧羰基。
(C1-C8)-卤烷基是由一个或多个卤素原子取代的(C1-C8)-烷基。
在本发明的范围内，(C3-C18)-杂芳基表示具有3到18个碳原子并且在环上含有诸如氮、氧、或硫杂原子的五、六或七员芳环系统。这些杂芳香化合物被特别认为是如下基团1-，2-，3-呋喃基、1-，2-，3-吡咯基、1-，2-，3-噻吩基、2-，3-，4-吡啶基、2-，3-，4-，5-，6-，7-吲哚基、3-，4-，5-吡唑基、2-，4-，5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基、2-，4-，5-，6-嘧啶基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C4-C19)-杂芳烷基被理解成是相应于(C7-C19)-芳烷基的杂芳香系统。
适当的卤素是氟、氯、溴和碘。
在本发明的范围内，富集对映体的表达被理解成指与其光学对映体混合的对映体的比例在＞50％到＜100％的范围内。
所示结构涉及所有可能的非对映体和对映体以及它们可能的混合物。
引用的参考文献被认为是包括在本发明的公开事实内。
权利要求
1.通过用水解酶来酶水解N-未保护β-氨基酸酯对映体混合物制备富集对映体的N-未保护β-氨基酸的方法，条件是不使用相应的甲基或乙基酯。
2.如权利要求1的方法，其特征在于使用β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。
3.如权利要求2的方法，其特征在于使用相应的正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、或叔丁基酯。
4.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应的pH值为4-10，优选6-9，并且最优选7-8.5。
5.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应中的温度为-15-+100℃，优选为+15-+40℃，并且最优选为+20-+30℃。
6.如前述权利要求之一的方法，其特征在于使用脂肪酶，优选使用来自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS。
7.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应在酶-膜反应器中实施。
8.如前述权利要求之一的方法，其特征在于所述水解在水介质中进行，可以向其中加入水溶性的有机溶剂。
9.具有以下结构(I)的β-氨基酸正丙酯 其中，R代表(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-环烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-杂芳基、(C4-C19)-杂芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-环烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-杂芳基；R’代表H、(C1-C8)-烷基、(C2-C8)-烯基、(C2-C8)-炔基、(C3-C8)-环烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-杂芳基、(C4-C19)-杂芳烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C8)-环烷基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C6-C18)-芳基、((C1-C8)-烷基)1-3-(C3-C18)-杂芳基。
10.权利要求9的化合物在权利要求1方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及制备富集对映体的β－氨基酸的方法。本发明还涉及以下通式(I)的有益的β－氨基酸酯并且涉及它们在酶制备富集对映体β－氨基酸的方法中的用途。
文档编号C12P13/00GK1456675SQ0312342
公开日2003年11月19日 申请日期2003年5月7日 优先权日2002年5月8日
发明者哈拉尔德·格勒格尔, 黑尔格·维尔纳 申请人:德古萨股份公司