通过联合治疗的半胱天冬酶-3酶原激活的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于诱导细胞死亡例如癌细胞死亡的组合物和方法。公开了化合物的结合物以及相关的使用方法，包括化合物用于治疗癌症以及选择性诱导细胞凋亡的用途。与其他化合物以及化合物的结合物相比，所公开的药物结合物具有较低的神经毒性作用。
【专利说明】通过联合治疗的半胱天冬酶-3酶原激活
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求依照35U.S.C. § 119(e)于2012年3月6日提交的第61/607, 098号 美国临时专利申请的优先权，该临时专利申请通过引证方式纳入本申请。
【背景技术】
[0003]细胞凋亡或程序性细胞死亡在所有多细胞生物的发育和维持稳态过程中起着重 要作用。癌症的常见标志是抵抗自然的细胞凋亡信号。根据癌症类型，这种抵抗通常是由于 细胞凋亡级联反应中关键蛋白的上调或下调，或者是由于编码这些蛋白的基因中的突变。 这些变化在内源性细胞凋亡途径和外源性细胞凋亡途径中均有发生，其中内源性凋亡途径 通过线粒体和半胱天冬酶-9汇集，外源性凋亡途径涉及死亡受体与半胱天冬酶_8的作用。 例如，已经在癌症中观察到了蛋白质--如p53、Bim、Bax、Apaf-1、FLIP和许多其他蛋白 质--的适当水平的改变。这些改变可导致有缺陷的细胞凋亡级联反应，其中是上游的促 细胞凋亡信号没有被充分地传递以激活执行者半胱天冬酶--半胱天冬酶_3和半胱天冬 酶-7。
[0004] 由于大多数细胞凋亡途径最终都涉及半胱天冬酶-3酶原的激活，上游的基因异 常可有效地"打断"细胞凋亡线路，因此，这些细胞非典型地增殖。鉴于细胞凋亡在癌症中 的重要作用，致力于开发靶向细胞凋亡级联反应中的特异蛋白质的治疗剂。例如，与级联成 员诸如P53和Bel家族中的蛋白质结合的肽或小分子结合剂，或者与细胞凋亡抑制剂（IAP) 蛋白质家族结合的肽或小分子结合剂，具有促细胞凋亡活性，促进Apaf-1寡聚的化合物也 同样具有促细胞凋亡活性。然而，因为这些化合物靶向细胞凋亡级联反应中的早期（或中 间到高）位置，因此，具有影响这些成员的下游蛋白质的突变的癌症仍然可抵抗这些化合 物的可能的有益效果。
[0005] 对治疗目的有利的是识别直接激活细胞凋亡级联反应中远端下游（far downstream)的促细胞凋亡蛋白质的小分子。这种方法可涉及级联反应中相当较低的位置， 因此，使得甚至能够杀死那些具有影响上游细胞凋亡机器的突变的细胞。此外，如果促细胞 凋亡蛋白质在癌细胞中被上调或者以增加的水平存在于癌细胞中，则这样的治疗策略会具 有较高的成功可能性。因此，靶向细胞凋亡的下游效应物蛋白--半胱天冬酶_3酶原-- 的小分子的识别，将显著有助于目前的癌症治疗。
[0006]半胱天冬酶-3酶原到半胱天冬酶-3的转化或激活导致产生活性"执行者"半胱天 冬酶形式，所述活性"执行者"半胱天冬酶形式随后催化众多蛋白底物的水解。活化的半胱 天冬酶-3是异源二聚体的同源二聚体，并且是通过半胱天冬酶_3酶原的蛋白酶解产生的。 在体内，这种蛋白酶解激活通常通过半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的作用而发生。为确 保酶原不被过早地激活，半胱天冬酶-3酶原具有12个氨基酸"保险栓（safety catch) "， 其阻止进入蛋白酶解的ETD位点（氨基酸序列，ile-glu-thr-asp)。这种保险栓使得半胱 天冬酶-3酶原能够抵抗自身催化激活和由半胱天冬酶_9导致的蛋白酶解。突变研究表明 三个连续的天冬氨酸残基似乎是该保险栓的关键成分。保险栓的位置对pH敏感，因此，一 旦发生细胞酸化（如在细胞凋亡过程中发生），保险栓被认为允许进入蛋白酶解的位点，活 性半胱天冬酶-3可通过半胱天冬酶-9的作用或经由自身激活机制而产生。
[0007] 在某些癌症中，半胱天冬酶-3酶原的水平相对于正常组织是提高的。对来自20 位结肠癌患者的原代分离物（primary isolates)的研究显示，平均而言，相对于邻近的非 癌性组织，半胱天冬酶-3酶原在这些分离物中被上调了六倍。此外，在某些神经母细胞瘤、 淋巴瘤和肝癌中，半胱天冬酶-3酶原被上调。而且，在被国立癌症研究所（NCI)开发治疗 项目（Developmental Therapeutics Program)用于癌症筛选的60个细胞系组（cell-line panel)中进行了半胱天冬酶-3酶原水平的系统性评估，这揭示了某些肺癌、黑素瘤、肾癌 和乳腺癌显示显著升高的半胱天冬酶-3酶原表达水平。
[0008] 由于活性半胱天冬酶-3在实现细胞凋亡中的作用，在某些癌性细胞类型中相对 高水平的半胱天冬酶-3酶原以及令人感兴趣的保险栓-介导的半胱天冬酶_3酶原自身激 活的抑制，直接修饰半胱天冬酶-3酶原的小分子可在靶向癌症治疗中具有很大应用。
[0009] 联合治疗已经成为治疗癌症患者的标准。联合治疗药物鸡尾酒疗法的目的是在化 学治疗剂之间实现协同或加和效果，借此有助于缩短治疗时间，降低毒性并增加患者存活 率。作用于单一生化途径的药物对协同或增强作用而言是特别强有力的候选者，因为，它们 可以模拟"合成致死"基因组合（"synthetic lethal" genetic combinations)。例如， 聚（ADP-核糖）聚合酶-l(PARP-l)(-种促进DNA损伤修复的酶）的抑制剂，有效地与DNA 损伤剂协同作用，如在细胞培养物、动物模型和人体临床试验中所证明的。然而，仍需要更 加有效的疗法用于治疗多种形式的癌症，抗癌药物的新的协同组合将有助于该诉求。因此， 需要识别新的细胞毒性剂，它们在杀死癌细胞方面是有效的，同时还保护正常宿主组织免 受细胞毒性剂的不期望的毒性。
【发明内容】
[0010] 本发明主要提供化合物、组合物以及治疗处理的方法。在多种实施方案中，本发明 适用于多种癌症疾病和癌细胞类型，如乳腺癌、淋巴瘤、肾癌、黑素瘤、白血病、神经细胞瘤、 肺癌、脑癌和本领域已知的其他癌症。本文尤其公开了包括能够诱导细胞死亡的小分子的 组合物和方法。在一些实施方案中，所述组合物和方法涉及可直接或间接与程序性细胞死 亡途径成员如半胱天冬酶-3酶原相互作用的化合物。在某些实施方案中，与直接或间接与 程序性细胞死亡途径成员如半胱天冬酶-3酶原相互作用的其他化合物相比，所述组合物 和方法具有降低的神经毒性。
[0011] 联合抗癌治疗可由靶向不同生化途径的药物组成，或者由那些在相同途径中攻击 不同靶标的化合物组成，模拟"合成致死"的基因组合。半胱天冬酶-3酶原激活剂PAC-1 和第二活性剂的结合物对于诱导癌细胞的细胞凋亡性死亡已经显示出相当大的协同作用， 经常达到完全超过加和效果的程度。PAC-1和第二活性剂的结合物可用于有效降低肿瘤模 型中的肿瘤负荷，其中单独的化合物具有极小的效果或没有效果。本文中描述的数据显示 了 PAC-1/第二活性剂结合物用于治疗癌症的效力，更广义而言，显示出结合物可协同作用 并提供显著加强的治疗益处。
[0012] 因此，本发明提供一种组合物，其包含：
[0013] (a)化合物 PAC-1:
【权利要求】
1. 一种组合物，包括 (a) 化合物PAC-I:
(b) 第二活性剂，其中所述第二活性剂是依托泊苷、硼替佐米、十字孢碱、多柔比星、他 莫昔芬、顺钼、卡钼或紫杉醇，以及 (c) 药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
2. 权利要求1的组合物，其中所述载体包括水和任选地缓冲剂、环糊精或其结合物。
3. 权利要求2的组合物，其中所述环糊精是2-羟丙基-P-环糊精。
4. 权利要求1的组合物，其中PAC-I的浓度为约2iiM至约50iiM。
5. 权利要求1的组合物，其中所述第二活性剂的浓度为约25nM至约ImM。
6. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是依托泊苷，并且依托泊苷的浓度为 约 2iiM至约 50iiM0
7. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是硼替佐米，并且硼替佐米的浓度为 约 50nM至约 20iiM。
8. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是十字孢碱，并且十字孢碱的浓度为 约 25nM至约 200nM。
9. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是多柔比星，并且多柔比星的浓度为 约50nM至约5uM。
10. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是他莫昔芬，并且他莫昔芬的浓度 为约5iiM至约50iiM。
11. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是顺钼，并且顺钼的浓度为约5yM 至约150iiM，所述第二活性剂是卡钼，并且卡钼的浓度为约5iiM至约150iiM。
12. 权利要求1或4的组合物，其中所述第二活性剂是紫杉醇，并且紫杉醇的浓度为约 0. 5nM至约 5nM。
13. -种抑制癌细胞生长或增殖的方法，包括使癌细胞与有效量的权利要求1的组合 物接触，从而抑制癌细胞生长或增殖。
14. 权利要求13的方法，其中所述癌细胞是淋巴瘤细胞、骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞或卵 巢癌细胞。
15. -种在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括使癌细胞与有效量的化合物PAC-I和 有效量的第二活性剂接触，
其中所述第二活性剂是依托泊苷、硼替佐米、十字孢碱、多柔比星、他莫昔芬、顺钼、卡 钼或紫杉醇；从而在癌细胞中诱导细胞凋亡。
16. 权利要求15的方法，其中所述接触为在体外。
17. 权利要求15的方法，其中所述接触为在体内。
18. 权利要求15-17中任一项的方法，其中所述癌细胞与PAC-I和第二活性剂同时接 触。
19. 权利要求15-17中任一项的方法，其中在所述癌细胞与所述第二活性剂接触之前 使所述癌细胞与PAC-I接触。
20. 权利要求15-17中任一项的方法，其中在所述癌细胞与所述第二活性剂接触之后 使所述癌细胞与PAC-I接触。
21. -种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括同时或相继给予患者治疗有效量的 化合物PAC-I和有效量的第二活性剂，
其中所述第二活性剂是依托泊苷、硼替佐米、十字孢碱、多柔比星、他莫昔芬、顺钼、卡 钼或紫杉醇；从而治疗癌症。
22. 权利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性剂同时给药。
23. 权利要求21的方法，其中所述化合物PAC-I和所述第二活性剂相继给药。
24. 权利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性剂之前给药。
25. 权利要求23的方法，其中所述化合物PAC-I在所述第二活性剂之后给药。
26. 权利要求21-25中任一项的方法，其中所述癌症是淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺癌。
27. 权利要求1-10中任一项的组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
28. 权利要求27的用途，其中所述癌症是淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌或卵巢癌。
【文档编号】A61K33/24GK104507479SQ201380023803
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2012年3月6日
【发明者】保罗·J·赫甘罗斯尔, 瑞秋·C·博特姆, 蒂莫西·M·范, 马克·J·吉尔伯特, 迈克尔·K·汉德里, 霍华德·S·罗斯, 索多尔·M·塔拉索 申请人:伊利诺伊大学评议会, 抑制肿瘤公司