使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通 过酶转化为L-甲硫氨酸和H3P04。所述转化通过称为依赖0-磷酸-L-高丝氨酸（0HPS)的 甲硫氨酸合酶的酶实现。本发明还提供了依赖〇-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶，即能 够将〇-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H 3P〇d9蛋白质。本发明还 涉及已经过基因修饰从而能从0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的微生物。
[0002] 所述酶和方法也能有利地用于合成甲硫氨酸的衍生物如S-腺苷甲硫氨酸、谷胱 甘肽、半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸和甲硫腺苷。本发明还提供了筛选催化0-磷酸-L-高 丝氨酸和甲硫醇至L-甲硫氨酸和H 3P04转化的酶的方法。
【背景技术】
[0003] L-甲硫氨酸是源自从通过激活L-天冬酰磷酸接着还原至L-天冬氨酸半醛和 L-高丝氨酸的L-天冬氨酸的代谢中必需的氨基酸。在细菌以及真菌中，L-高丝氨酸经过 0-乙酰化作用来形成琥珀酰酯或乙酰酯，所述酯本身经过直接用硫化物（SH 2)的硫缩合作 用以形成L-高半胱氨酸或在转化为高丝氨酸之前间接用L-半胱氨酸以形成L-光硫醚。接 着使用甲基四氢叶酸使高半胱氨酸甲基化以形成甲硫氨酸。
[0004] 在植物中，作为胱硫醚前体使用的L-高丝氨酸酯为0-磷酸-L-高丝氨酸。通过 胱硫醚0裂合酶的作用，之后将胱硫醚转化为高半胱氨酸。高半胱氨酸的甲基化之后形成 甲硫氨酸。〇-磷酸-L-高丝氨酸也存在于通过磷酸-吡哆醛酶苏氨酸合酶（EC 4. 2. 3. 1) 作用的细菌、植物、真菌和哺乳细胞的代谢中，作为L-苏氨酸的直接前体。在植物中，存在 严格的调控功能从而将碳通量在〇-磷酸-L-高丝氨酸分叉点控制在蛋氨酸和苏氨酸（Amir 等，TRENDS Plant Science 7(2002)，153)。文献（详见例如 Kreft 等，Plant Physiol， 104 (1994)，1215 ;Ravanel 等，Arch. Biochem.Biophys. 316 (1995)，572)中已报道 了随着 0-磷酸-L-高丝氨酸转化为L-胱硫醚和L-高半胱氨酸，同时释放磷酸，L-半胱氨酸和硫 化物（SH 2)都可以通过植物胱硫醚Y合酶缩合。还报道了非常限制硫基底物的范围，除了 L-半胱氨酸，只有少数底物能被接受。
[0005] 虽然其为必需的氨基酸，在动物中，甲硫氨酸并不是初始合成的，动物必须摄取甲 硫氨酸或包含甲硫氨酸的蛋白质或相关的含硫化合物。特别地，甲硫氨酸对于家禽和牲畜 喂养是必需的并在家禽和牲畜食用的蔬菜中存在量不足。有效饲养因而需要外部甲硫氨酸 供应。至今，如果并非全部那么绝大多数用于喂养动物的甲硫氨酸源自石油化工。制备甲 硫氨酸的一个局限在于还原硫消耗的能量成本。因此，需要能提供其他制备此氨基酸的途 径，优选通过使用可再生来源，其能允许使用微生物，在所使用的微生物中甲硫氨酸的合成 适应工业规模生产。
【发明内容】
[0006] 本发明通过提供用于制备L-甲硫氨酸的方法来说明此需要，所述方法中0-磷 酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3P04。在所述方法中，硫的来源是 甲硫醇。在此化合物中，硫通过已经还原的硫化物提供。此外，与取决于使用乙酰化的或琥 珀酰化的高丝氨酸衍生物的标准代谢途径相比，使用〇-磷酸-L-高丝氨酸作为前体，每分 子合成的甲硫氨酸节省了至少两个碳原子。总体而言，此途径在合成甲硫氨酸及其衍生物 中允许较佳产量。
[0007] 因此，本发明涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中L-甲硫氨酸按照以下反应方 案通过酶制备：
[0008] 0-磷酸-L-高丝氨酸+CH3-SH〈 = >L-甲硫氨酸+H3P04
[0009]目前没有报告表示天然存在具备将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫 氨酸的能力的蛋白质。本发明的发明人考虑以节省成本的方法从〇-磷酸-L-高丝氨酸和 甲硫醇制备L-甲硫氨酸的选择并为此目的，设计不是天然存在的并具有将0-磷酸-L-高 丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质。从所附实施例显而易见，本发明的发明人开 发的体系允许制备具有将〇-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H 3P04的能 力的酶。此外，本发明的发明人已经成功通过引用此体系产生新的酶变体，所述酶变体衍生 自已存在的酶，所述酶突变体具有将0-磷酸-L -高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和 H3P04的能力。为此目的，其从已存在的未显示将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲 硫氨酸和成?0 4的能力的酶开始，从所述存在的酶制备突变体并选择显示将0-磷酸-L-高 丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H 3P04的能力的酶。因此，本发明的发明人能确定之 前并未描述过的新的酶活性并提供用于制备相应酶的可靠的并可再生的方法。在本发明的 上下文中，相应的酶指依赖〇-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶。
[0010] 因此，本发明特别涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中0-磷酸-L-高丝氨酸和 甲硫醇按照以下反应方案通过酶转化为L-甲硫氨酸和H 3P04:
[0011] 0-磷酸-L-高丝氨酸+CH3-SH〈 = >L-甲硫氨酸+H3P04其中通过酶的转化通过使 用依赖〇-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶实现。
[0012] 原则上，任意依赖0-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶，即，任意具有将0-磷 酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和11 3?04的能力的蛋白质可用于根据本发明的 方法。本发明首次描述了显示此能力的蛋白质并提供了用于提供其他显示此能力的蛋白质 的方法。特别地，本发明公开了有可能从天然不具备将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化 为L-甲硫氨酸的能力的植物胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)，通过突变和选择制备具有此能 力的变体。
[0013] 将在下文根据本发明的蛋白质的部分中进一步描述依赖0-磷酸-L-高丝氨酸的 甲硫氨酸合酶并且在根据本发明的方法中，可以使用任意所述的依赖〇-磷酸-L-高丝氨酸 的甲硫氨酸合酶。
[0014] 从所附实施例中显而易见，本发明的发明人成功制备了显示出将0-磷酸-L-高丝 氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H 3P04的能力的几种不同的蛋白质。这些蛋白质的序列 在SEQ ID No :6至29中显示。这些蛋白质通过如实施例中描述的来自植物胱氨酸y合酶 (EC 2.5. 1.48)的筛选体系中的突变和选择制备，所述胱氨酸Y合酶天然不具备将〇-磷 酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的能力。
[0015] 此外，从SEQ ID No :6至29中显示的序列，有可能提供其他保留了将0-磷 酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和耻04的活性的蛋白质。例如，有可能进一 步增加蛋白质与底物〇-磷酸-L-高丝氨酸和/或至底物甲硫醇的亲和性或改进如下进一 步描述的蛋白质的其他特性。因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，〇-磷酸-L-高 丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H 3P04通过使用蛋白质实现，所述蛋白质选自 组成如下的群组：
[0016] (a)包括SEQ IDNo:6至29中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质；和
[0017] (b)具备与SEQ ID No :6至29中任一个至少60%的序列等同性并具有将0-磷 酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶活性的蛋白质。
[0018] 将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶活性可以例如 通过所附实施例中描述的试验评估。为此目的，例如，有可能使具有甲硫氨酸营养缺陷型表 型的酿酒酵母（S.cerevisiae)菌株。此类菌株的例子是其中高丝氨酸转乙酰酶和高半胱 氨酸合酶被移除或使其机能障碍的菌株。优选地，将两种酶全部移除或使其全部机能障碍。 如图1所示，酿酒酵母取决于必须使用的0-乙酰基-高丝氨酸来合成高半胱氨酸，高半胱 氨酸之后被转化为甲硫氨酸。所述酶，负责合成〇-乙酰基高丝氨酸的高丝氨酸转乙酰酶由 MET2基因编码。在MET2失去活性后，高丝氨酸不能再被转化为0-乙酰基高丝氨酸并且所 有的高丝氨酸通量向磷酸高丝氨酸转化。由于MET2催化反应是酵母中仅有的0-乙酰基高 丝氨酸来源，MET2基因的失活导致了酵母菌株表现为严格的甲硫氨酸营养缺陷型表型。但 是，高半胱氨酸（最后的甲硫氨酸前体）可衍生自半胱氨酸（通过转硫作用途径）或衍生 自S-腺苷甲硫胺酸的再循环。为了确保完全不会合成甲硫氨酸，MET6,编码负责从高半胱 氨酸和甲基四氢叶酸合成甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基转移酶的基因也被删除。
[0019] 因此，在用于检测蛋白质将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和 耻0 4的能力的试验中，可以优选使用酿酒酵母菌株，其中将MET2和/或MET6基因删除或 破坏，优选将两者都删除或破坏。双met2Amet6△破坏的菌株不能在没有甲硫氨酸的存在 下生长并且特别不能在甲硫醇作为硫源存在下生长。所述菌株不再能合成0-乙酰基高丝 氨酸但是产生〇-磷酸-高丝氨酸。可以之后将此类酵母菌株用编码蛋白质的核酸分子转 化，待测所述蛋白质将〇-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和成?0 4的能力。 所述菌株在介质中/上生长，所述介质包含甲硫醇作为唯一的硫源并且在此类介质上的生 长能力表示表达的蛋白质能将0-磷酸-L-高丝氨酸（0HPS)和甲硫醇转化为L-高丝氨酸 和H 3P04。甚至更优选使用其中编码苏氨酸合酶的基因也例如通过删除或破坏而机能障碍 的菌株。在met2A met6A菌株中，在通过THR1基因编码的高丝氨酸激酶催化的反应中合 成0PHS，但由于0PHS通过THR4基因编码的苏氨酸合酶活性转化为苏氨酸，0PHS不可能充 分聚集。所述三方1^七2八!11的6八也4八突变体菌株因而允许检测非常低的依赖〇即5的甲 硫氨酸合酶的活性并已经用作细胞的首次筛选来分离赋予依赖0HPS的甲硫氨酸合酶活性 的新的蛋白质。
[0020] 此酶的活性也可以进一步地通过体外的试验确定，其中0-磷酸-L-高丝氨酸和 甲硫醇在体外适宜条件下用源自表达待测蛋白质的酵母菌株的非细胞提取物或用待测 的（部分地）纯化的蛋白质培育，并且其中通过液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/MS)，使用 C 13甲硫氨酸作为内部对照（Ravanel 等。Archives of Biochemistry and Biophysics 316 (1995)，572-584)检测到甲硫氨酸的制备。
[0021] 在所述体外试验中作为底物使用的0-磷酸-L-高丝氨酸可以通过例如图2所示 的方法（Barclay 等，J. Chem. Soc，Chem. Com(1994) 815-816)提供。
[0022] 如上所述，显示将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3P0 4的酶 活性的蛋白质的例子是那些具备SEQ ID No :6至29中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质。 因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法使用包括SEQ ID No :6至29中任一个 所示的氨基酸序列的蛋白质。但是，当然也有可能使用这些蛋白质的变体，即蛋白质的氨基 酸序列显示与SEQ ID No :6至29中任一个所示的氨基酸序列的高度序列等同性，并且其 显示出将〇-磷酸-