L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H 3P〇d9酶活性。与SEQ ID No :6至29中任一个所示的序列的序列等同性至少为60%，优选至少为70%，甚至更优选 至少80%，至少85%，至少90%或至少95%并最优选至少96%、97%、98%或99%。优选 地，等同性的程度通过将相应序列与SEQ ID No :6至29中任一个所示的氨基酸序列对比确 定。当对比的序列不具备同样的长度，等同性程度优选指在较短序列中氨基酸残基与在较 长序列中氨基酸残基等同的百分比或指在较长序列中氨基酸残基与在较短序列中氨基酸 残基等同的百分比。序列等同性的程度可以根据本领域熟知的方法，优选使用适宜的计算 机程序如CLUSTAL确定。
[0023] 当使用CLUSTAL分析方法来确定特定的序列是否例如80%等同于参照的序列，可 以使用默认设置或优选以下设置：矩阵：代矩阵30 ;开放空位罚分：10. 0 ;延伸空位罚分： 0. 05 ;延迟失真：40 ;空位分离距离：8,用于对比氨基酸序列。对于核苷酸序列对比，延伸空 位罚分优选设置在5.0。
[0024] 优选地，在序列的完整长度上计算等同性程度。此外，如果在本发明的上下文中使 用"同源性"，此术语优选表示"序列等同性"。
[0025] 根据本发明的方法还允许制备其他衍生自L-甲硫氨酸的含硫化合物。所述化合 物的例子是S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、甲硫基腺苷和2-氧 代-4-甲硫基丁酸酯。
[0026] 因此，本发明还涉及用于制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其包括如上所述的根据本 发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中将L-甲硫氨酸根据以下反应进一步转化为 S-腺苷甲硫氨酸：
[0027] 甲硫氨酸+ATP=>S_腺苷甲硫氨酸+PPi+Pi
[0028] 此通过酶的反应在本领域中已知并且催化此反应的酶在本领域中已知。这些酶被 称为S-腺苷甲硫氨酸合酶（EC 2. 5. 1. 6)。对应酶的实施例为酵母中的SAM1和SAM2。因 此，在所述方法在生物体中进行的情况下，所述生物体优选过度表达对应的能将L-甲硫氨 酸转化为S-腺苷甲硫氨酸的酶。
[0029] 也可能有利地将所述生物体进一步修饰从而避免S-腺苷甲硫氨酸的通量进入其 他代谢途径。在酵母中，例如有可能有利地失活腺苷激酶的活性（EC 2. 7. 1. 20,在酵母中通 过AD01基因编码）从而将S-腺苷甲硫氨酸的通量降低至S-腺苷高半胱氨酸。
[0030] 此外，本发明还涉及用于制备半胱氨酸的方法，其包括如上所述的根据本发明的 用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸被进一步转化为半胱氨酸。本领域已知 L-甲硫氨酸至半胱氨酸的转化并且该转化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实 现。例如，可以首先将L-甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸，其之后进一步根据以下反应被 转化为S-腺苷高半胱氨酸：
[0031]S-腺苷甲硫氨酸+甲基受体=>s-腺苷高半胱氨酸+甲基化受体
[0032] 此反应通过依赖S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶催化。
[0033]S-腺苷高半胱氨酸可以之后根据以下反应被进一步转化为L-高半胱氨酸：
[0034]S-腺苷高半胱氨酸〈=>L_高半胱氨酸+腺苷
[0035] 此反应通过S-腺苷高半胱氨酸水解酶，EC3. 3. 1. 1催化。
[0036] 之后L-高半胱氨酸可以根据以下反应被转化为L-胱硫醚：
[0037]L-高半胱氨酸+L-丝氨酸〈=>L_胱硫醚+H20
[0038] 此反应通过胱硫醚0合酶（EC4. 2. 1. 22)催化。
[0039] 最终，L-胱硫醚根据以下反应被转化为半胱氨酸：
[0040]L-胱硫醚+H20〈 = >L_半胱氨酸+NH3+氧代丁酸酯
[0041] 此反应通过胱硫醚Y_裂合酶催化（EC4. 4.1. 1)。
[0042] 如果所述方法在酵母中进行，有利地过度表达以下基因：SAM1、SAM2、SAH1、STR4 和STR1。此外，应将编码酵母胱硫醚Y合酶的基因STR2删除从而降低从半胱氨酸至高半 胱氨酸的反向合成。类似地，所述酵母还有利地包括MET突变，其废除依赖甲基四氢叶酸的 甲硫氨酸合酶以及去除DUG2基因，其在主要的谷胱甘肽降解途径中涉及。
[0043] 此外，本发明还涉及用于制备谷胱甘肽的方法，其包括上述根据本发明的用于制 备L-甲硫氨酸的方法并且其中将L-甲硫氨酸进一步转化为谷胱甘肽。本领域中已知L-甲 硫氨酸至谷胱甘肽的转化并且该转化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现。例 如，L-甲硫氨酸可以首先被转化为S-腺苷甲硫氨酸，其之后进一步如上所述被转化为胱氨 酸并且由此制备的胱氨酸根据以下反应被进一步转化为Glu-Cys(y-L-谷酰基-L-胱氨 酸）：
[0044]ATP+L-谷氨酸酯+L-胱氨酸〈=>y-L-谷酰基-L-胱氨酸+ADP+Pi
[0045] 此反应通过谷氨酸半胱氨酸连接酶（EC6. 3. 2. 2)催化。
[0046] 由此制备的Glu-Cys之后根据以下反应被进一步转化为谷胱甘肽：
[0047]ATP+y-L-谷酰基-L-胱氨酸+甘氨酸=谷胱甘肽+ADP+Pi
[0048] 此反应通过谷胱甘肽合酶（EC6. 3. 2. 3)催化。
[0049] 如果所述反应在酵母中进行，优选联系用于制备胱氨酸的方法如上设计酵母并且 所述酵母也应过度表达在胱氨酸至谷胱甘肽的转化中涉及的基因GSH1和GSH2。在特别优 选的实施方案中，GSH1基因表达了耐反馈的酶。
[0050] 此外，本发明还涉及用于制备2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的方法，其包括根据如上 所述的本发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸根据以下反应被进一步 传化为2-氧代-4-甲硫基丁酸酯：
[0051] 甲硫氨酸+2-氧代酸=>2-氧代-4-甲硫基丁酸酯+L-氨基酸
[0052] 本领域已知此通过酶的反应并且本领域已知催化此反应的酶。这些酶被称为甲 硫酸氨转氨酶（EC2. 6. 1.88)。对应的酶的例子是酵母中的八1?08、841'1、8412。因此，在所 述方法在生物体中进行的情况下，所述生物体优选过度表达能将L-甲硫氨酸转化为2-氧 代-4-甲硫基丁酸酯的对应的酶。
[0053] 也有可能有利地将所述生物体进一步修饰从而避免2-氧代-4-甲硫基丁酸酯 的通量进入其他代谢途径。在酵母中，例如有可能有利地失活苯丙酮酸脱羧酶的活性 (EC4. 1. 1. 43,通过酵母中AR010基因编码）或丙酮酸脱羧酶的活性（EC4. 1. 1. 1，通过酵母 中H)C1、PDC5和H)C6基因编码）从而将2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的通量降低至3-(甲硫 基）丙醛。
[0054] 根据本发明的方法可以在体外或体内进行。体外反应被理解为是其中不使用细胞 的反应，即，非细胞的反应。因此，体外优选表示没有细胞的体系。在一个实施方案中，术语 "体外"表示存在分离的酶。在一个实施方案中，在方法中使用的酶以纯化的形式使用。
[0055] 为了在体外进行所述方法，用于反应的底物和酶在使酶具有活性并且使通过酶的 转化发生的条件下（缓冲液，温度等）培育。使所述反应进行足够的时间以制备L-甲硫氨 酸。L-甲硫氨酸的制备可以通过本领域已知的方法测量。
[0056] 所述酶可以是任意使通过酶的反应发生的适宜形式。其可以被纯化或部分纯化或 以粗细胞提取物的形式或部分纯化的提取物的形式。也有可能将酶固定在适宜的载体上。
[0057] 在另一个实施方案中，根据本发明的方法在培养液中，在生物体，优选微生物的存 在下进行，制备的蛋白质具有将〇-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H 3P04 的能力。此蛋白质是本文中所述的蛋白质。
[0058] 在所述方法中使用的生物体优选为本文所述的根据本发明的宿主细胞。
[0059] 本发明还涉及具有将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的 能力的蛋白质。在本发明的上下文中，所述酶指依赖0HPS的甲硫氨酸合酶。如上所述，目 前没有报道表明天然存在具有将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白 质并且本发明是首次提供此类允许如上文所述的根据本发明的方法制备L -甲硫氨酸的 蛋白质。
[0060] 在优选的实施方案中，根据本发明的具有将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶 转化为L-甲硫氨酸的能力的蛋白质通过突变衍生自胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)。所述 突变可以是在胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)的氨基酸序列中，一个或更多个氨基酸残基的 取代和/或一个或更多个氨基酸残基的删除和/或一个或更多个氨基酸残基的加入。
[0061] 已知并描述了用于各种生物体的胱硫醚y合酶。例如，对于植物，已知大于350 个用于胱硫醚y合酶的序列，尤其是用于拟南芥、烟草、小麦、番茄、稀脉萍、马铃薯、菠菜、 总状紫云英、双沟黄芪、紫云英和抱茎假含羞草。
[0062] 还已知来自细菌和真菌的胱硫醚y合酶。对于细菌，已经描述了大于22000个 序列并且对于细菌和真菌序列的例子是源自酿酒酵母、粗糙链孢霉、肠道沙门氏菌、大肠杆 菌、根癌土壤杆菌、粪产碱菌、解硫胺素芽孢杆菌属、短小芽胞杆菌、枯草杆菌、谷氨酸棒状 杆菌、幽门螺杆菌、球形芽孢杆菌芽孢杆菌、结核分枝杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、德阿昆合 假单孢菌、恋臭假单胞菌、产褐色链霉菌。
[0063] 用于提供显示将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H 3P04的活 性的蛋白质的方法在所附实施例中描述并将在下文更详细地描述。原则上，可以使用任意 的胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)作为初始材料来提供显示将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫 醇转化为L-甲硫氨酸和呀04的活性的蛋白质。优选将0-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转 化为L-甲硫氨酸和氏?0 4的活性的蛋白质，其衍生自胱硫醚Y合酶（EC 2.5. 1.48)，显示 与天然存在的胱硫醚y合酶至少70%，优选至少80%，甚至更优选至少90%和最优选至少 95%的序列等同性。
[0064] 在一个优选的实施方案中，从其衍生依赖0HPS甲硫氨酸合酶的胱硫醚Y合酶 (EC 2. 5. 1. 48)为植物胱硫醚y合酶（EC 2. 5. 1. 48)，优选来自拟南芥的胱硫醚y合酶 (EC 2. 5. 1. 48)CGS1，最优选的胱硫醚y合酶（EC 2. 5. 1. 48)显示SEQ IDNo :1所示的氨 基酸序列。在甚至更优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖0HPS的甲硫 氨酸合酶衍生自SEQ ID N〇:2显示的序列。除了实际上在84位上的甘氨酸残基通过丝氨 酸残基替换，此序列对应SEQ ID No :1。此替换，即mto突变，解除了通过S-腺苷甲硫氨 酸在 CGS1 上施加的翻译抑制（Onoue 等，Journal of Biological Chemistry 286(2011)， 14903-14911)。在特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖0HPS的甲硫 氨酸合酶衍生自SEQ ID No :3显示的序列。除了实际上胺基位于末端的以叶绿体为目标的 序列（氨基酸残基1至57)已被移除并且将甲硫氨酸残基在N-末端加入，此序列对应SEQ ID No:2