具有细胞内穿透能力的诱导rna干扰的核酸分子及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型结构的具有细胞内穿透能力的RNAi诱导核酸分子及其用 途，更具体地说，涉及一种具有优异的靶基因抑制效率且无需另外的细胞载体而具有细胞 内穿透能力的新型结构的核酸分子以及利用该核酸分子的靶基因的表达抑制方法，所述核 酸分子具有诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)或者二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)取代且结合有亲油性化合 物（lipophilic compound)的结构。
【背景技术】
[0002] RNA干扰（RNA interference :RNAi)是非常特异的能够有效抑制基因表达的机 制，该机制在细胞等中导入双链RNA(dsRNA)而诱导靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的 表达，其中，所述双链RNA(dsRNA)由具有与靶基因的mRNA同源序列的正义链和具有与靶基 因的mRNA互补序列的反义链构成。
[0003] 诱导这样的RNA干扰的siRNA是碱基序列能够特异性地抑制靶标基因表达的短 长度（19~21bp)的双链RNA，因为其具有高效率性和靶标特异性，因此目前作为难以治 疗的癌、病毒的感染以及遗传病等各种疾病的治疗剂备受关注。在利用siRNA的有效的 治疗剂开发方面，还存在稳定性、沉默效率（silencing efficiency)、免疫反应、脱祀效应 (off-target effects)等各种需解决的问题，其中体内（in vivo)的有效传递（delivery) 成为最难以解决的问题而被指出。siRNA因为磷酸骨架（phosphate backbone)结构而 带有高的负电荷（negative charge)，由此无法通过细胞膜，且因为其小的尺寸而在血液 (blood)中快速地被去除，由此难以传递充分量的siRNA以在实际靶标部位上实施RNAi诱 导。
[0004]目前，针对体外释药（in vitro delivery)开发出很多利用阳离子脂质体 (cationic lipids)和阳离子聚合物（cationic polymers)的高效传递（delivery)方 法(Sioud M， Sorensen DR Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice. Biochem Biophys Res Commun 2003 ;312 :1220_1225)。但是，大部分情况 下，在体内（in vivo)无法如体外（in vitro)那样高效率地传递siRNA，由于与生物体 内存在的各种蛋白质发生相互作用（interaction)，因此存在siRNA的传递效率变弱的 问题（Bolcato-Bellemin AL，Bonnet ME，Creusat G，et al. Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007;104:16050-16055)。另外，根据传递载体 (delivery vehicle)的组成，与发生疾病的部位无关地会在肝或肺等特定脏器中高浓度地 蓄积，因此还存在诱发毒性的问题。
[0005] 一方面，已知结缔组织生长因子（Connective tisssue frowth factor，CTGF/ CCN2)作为基质细胞蛋白（metricellular protein)的一种，其在细胞的分化、生长、迀移 (migration)、ECM生成（ECM production)、附着（adhesion)等方面起到重要的作用。在各 种脏器中诱导纤维化（fibrosis)而损坏脏器功能的慢性纤维化疾病（chronic fibrotic disorders)的情况下，确认到引起纤维化疾病（fibrotic disorder)的组织中CTGF被过 表达，在皮肤的情况下已较好地研宄出CTGF和纤维化（fibrosis)的关系。正常皮肤中 CTGF表达被抑制成正常水平（basal level)，但在发生创伤的情况下，则观察到CTGF的 表达暂时性地增加。与此相对，瘢痕瘤（keloid)或硬化症（localized sclerosis)的情 况下，在创伤治愈之后CTFG的过表达仍然持续，利用反义（antisense)等抑制CTGF的表 达时纤维化（fibrosis)以及瘢痕瘤（keloid)的生成被抑制，由此确认到CTGF在纤维化 (fibrosis)以及肥厚性瘢痕的生成起到重要的作用（Sisco M，Kryger ZB，0'Shaughnessy KD，et al. Antisense inhibition of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2) mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo. Wound R印air Regen 2008;16:661-673.D0I:WRR416[pii])。在病理学方面，报告有全长 CTGF 分 子与存在结缔组织细胞的过度增殖以及细胞外基质的过度沉积的状态相关联。本领域中 还记载有：CTGF与血管内皮细胞移动、增殖以及血管新生相关的状态相关联。作为与这些 状态相关的疾病以及障碍，可例举：皮肤以及主要器官的纤维症、癌，以及系统性硬化病、血 管生成、动脉粥样硬化症、糖尿性肾病以及肾性高血压等相关疾病、障碍。另外，还报告有： CTGF对创伤治愈、结缔组织恢复、骨以及软骨恢复等方面也有用。对于上述内容，已公开有 CTGF作为骨、组织或者软骨生成的诱导因子在骨质疏松症、骨关节炎或者骨软骨炎、关节 炎、骨骼疾病、肥厚性瘢痕、烧伤、血管性肥大症或者声音（sound)治愈等方面起到作用（例 如，参考文献（美国专利第5,837,258号））。
[0006] 为此，本发明人等为了提供可在体外（in vitro)以及体内（in vivo)实施有效 传递的具有朝向细胞内的穿透能力的新型结构的诱导RNAi的核酸分子而进行悉心研宄的 结果发现：诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一种核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)取代并结合（conjugation)亲油性化合物（lipophilic compound) 时，该核酸即使在体内（in vivo)也无需另外的细胞载体而具有优异的靶基因抑制效率并 同时具有优异的细胞内穿透能力，从而完成了本发明。
[0007] 该【背景技术】部分中记载的上述内容仅用于加深理解本发明的背景，对于本发明所 属的技术领域的技术人员来说，可能未包含构成已知现有技术的内容。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010](专利文献1)美国专利第5,837, 258号
[0011] 非专利文献
[0012] (非专利文献1)SioudM，SorensenDRCationicliposome-mediateddelivery ofsiRNAsinadultmice.BiochemBiophysResCommun2003 ；312 ：122〇-1225
[0013] (非专利文献2)Bolcato-BelleminAL，BonnetME，CreusatG，etal.Sticky overhangsenhancesiRNA-mediatedgenesilencing.ProceedingsoftheNational AcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2007 ；104 ：16050-16055
[0014] (非专利文献 3) Sisco M，Kryger ZB，0' Shaughnessy KD，et al. Antisense inhibition of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2)mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo. Wound Repair Regen 2008；16 ：661-673. DOI ：WRR416[pii]
【发明内容】
[0015] 本发明的目的在于，提供一种可在体外（in vitro)以及体内（in vivo)实施有效 传递且具有朝向细胞内的穿透能力的新型结构的诱导RNAi的核酸分子及其用途。
[0016] 为了达到上述目的，本发明提供一种RNAi诱导用核酸分子，其具有细胞内穿透 能力（cell-penetrating ability)，其特征在于，在由包含与革E核酸（target nucleic acid)互补区域的第一链和与所述第一链形成互补结合的第二链构成的诱导RNAi的 双链核酸分子中，所述核酸分子中含有的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯 (Phosphorothioate)或者二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)取代并结合有亲油性化合 物（lipophilic compound)〇
[0017] 本发明还提供一种基因表达抑制用组合物，其含有所述核酸分子。
[0018] 本发明还提供一种细胞内靶基因表达抑制方法，其包括细胞内导入所述核酸分子 的步骤。
[0019] 本发明还提供一种用于治疗或预防CTGF相关疾病或者障碍的药物组合物，其以 编码结缔组织生长因子（Connective tisssue frowth factor，CTGF)的mRNA作为革E核酸 并含有所述核酸分子。
[0020] 本发明还提供一种CT