小核糖核酸病毒样颗粒在植物中的产生的制作方法
【专利说明】小核糖核酸病毒样颗粒在植物中的产生 发明领域
[0001] 本发明涉及在植物中产生小核糖核酸病毒结构蛋白。更具体地，本发明也涉及在 植物中产生包含小核糖核酸病毒结构蛋白的病毒样颗粒。
[0002] 发明背景
[0003] 小核糖核酸病毒是小的无包膜的正链RNA病毒，其可以引起人和动物中多种临床 表现。基于包括序列同源性和酸敏感性的多种性质，小核糖核酸病毒被分为多个属，其中包 括多种人和动物的重要病原体。
[0004] 小核糖核酸病毒具有裸露的核衣壳。衣壳为排列为紧密包装的二十面体结构的60 个原体。每一原体由4个多肽组成，称为VP(病毒蛋白）1、2、3和4。VP2和VP4多肽起源 于被称为VP0的前体，VP0在病毒基因组RNA内化到细胞后被切割。VP4位于衣壳的内侧。 根据脱水类型和程度，病毒颗粒直径为约27-30nm。
[0005] 小核糖核酸病毒具有7.1-8.9kb的单组分、线性、多聚腺苷酸化的ssRNA(+)基因 组，其由编码多蛋白的单个0RF构成。病毒基因组RNA在5'端具有病毒蛋白（VPg)，代替 甲基化核苷酸帽结构。5'端长的UTR包含内部核糖体进入位点（IRES)。P1区编码结构多 肽。P2和P3区编码与复制有关的非结构蛋白。较短的3' UTR在（-)链合成中是重要的。 L为存在于一些属中的额外的N末端前导蛋白，其可以为蛋白酶（口蹄疫病毒，马鼻病毒） 或具有其他的功能（嵴病毒，心脏病毒）。
[0006] 病毒粒子RNA为感染性的，并且作为基因组和病毒信使RNA。IRES允多种蛋白的 直接翻译。由病毒蛋白酶将多蛋白最初加工为各种前体和成熟蛋白，从而产生结构蛋白、复 制酶、VPg和多种修饰宿主细胞、最终导致细胞溶解的蛋白。
[0007] 肠病毒71 (EV71)为单链RNA病毒的小核糖核酸病毒科的成员。它是无包膜病毒， 并且它的衣壳由多个作为单个病毒翻译产物的片段产生的外壳蛋白组成。图1(现有技术） 中呈现了病毒多蛋白到结构和非结构组分的加工。多蛋白基因的P1区编码结构蛋白，而P2 和P3区编码病毒的非结构组分。通过病毒蛋白酶2A将结构蛋白前体P1(图1中的1ABCD) 从多蛋白上切割之后，P1前体被加工为衣壳蛋白VP0、VP1 (图1中的1D片段）和VP3(图1 中的1C片段）。3C组分和它的前体3CD(P3区所编码）为负责将P1前体加工为衣壳蛋白 的病毒蛋白酶。VP0、VP1和VP3原体同时地组装为空的衣壳，并且据信，在空的颗粒组装后， 病毒RNA被包装到颗粒中。空的衣壳与基因组RNA的结合导致结构转换、RNA的内化、VP0 自动催化切割为VP2(图1中1B片段）和VP4(图1中1A片段），并成熟为稳定的150S病 毒粒子。通常在小核糖核酸病毒感染期间发现包含未切割的VP0前体的空的衣壳。
[0008] 已从P1前体蛋白与3⑶蛋白酶的共表达实现昆虫细胞中EV71VLP的产生（Hu et al.，2003, Biotechnology Letters 25:919-925)。Chung et al?描述了使用单个杆状病毒 载体产生P1和3⑶(2008, Vaccine 26:1855-1862)。小鼠中的免疫原性研宄显示，纯化的 EV71VLP为致死剂量的病毒处理提供了保护。
[0009] 来自于EV71的VP1蛋白产生于转基因番茄的果实中，并且用含有VP1 的转基因果实饲养小鼠导致VP1特异性粪便IgA和血清IgG的发展（Chen et al.，2006, Vaccine24:2944-2951)。
[0010] 口蹄疫病毒（FMDV)的PI前体蛋白和蛋白酶3C共表达在转基因苜蓿中（Dus Santos et al.，2005, Vaccine 23:1838-1843)。用包含 FMDV P1(1A、1B、1C、ID)的基因组 区、2A、2B的N末端的前16个氨基酸残基、3B1、3B2、3B3、3C的全序列和3D的N末端的前 16个氨基酸残基的单个载体稳定地转化苜蓿。通过Balb/c小鼠中腹腔内给药证明了来自 于转基因植物的粗蛋白提取物的免疫原性。免疫小鼠也得到抵抗致死的FMDV处理的保护。 用于实践目的的抗原表达的水平是低的。
[0011] 阿根廷申请AR078257公开了表达空的衣壳病毒的转基因植物，其中转基因植物 在它的基因组中包含编码与自动催化型2A蛋白酶连接的P1前体多肽的DNA构建体。该DNA 构建体还可包含连接于编码3C蛋白酶的序列的蛋白片段2B，3C蛋白酶与编码蛋白片段3D 的序列片段连接。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明涉及在植物中产生小核糖核酸病毒结构蛋白。更具体地，本发明也涉及在 植物中产生包含小核糖核酸病毒结构蛋白的病毒样颗粒。
[0014] 根据本发明，提供了在植物中产生包含小核糖核酸病毒样颗粒（PVLP)的方法，其 包括：
[0015] a)将第一核酸引入植物或植物的部分，第一核酸包含在植物中有活性的第一调节 区，第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的核苷酸序列可操作地连接；
[0016] b)引入第二核酸植物，第二核酸包含在植物中有活性的第二调节区，第二调节区 与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；
[0017] c)在允许第一和第二核酸表达的条件下培养植物、植物的部分，从而产生PVLP。
[0018]本发明还提供了产生小核糖核酸病毒样颗粒（PVLP)的方法（B)，其包括：
[0019] a)提供植物、植物的部分或植物细胞，所述植物、植物的部分或植物细胞包含第一 核酸和第二核酸，第一核酸包含在植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码一种或 多种小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地连接，第二核酸包含在植物中有活 性的第二调节区，第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；
[0020] b)在允许核酸表达的条件下，培养植物、植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。
[0021] 在植物中有活性的第一调节区和在植物中有活性的第二调节区可以是相同的或 不同的。
[0022] 此外，在方法（A)或（B)中，引入植物、植物的部分或植物细胞的第一核酸与第二 核酸的百分比率可以为95% :5%至50% :50%，或约20:1至约0.5:1。
[0023] 本发明还包括上述的方法（A)或（B)，其中第一核酸序列包含与一种或多种 豇豆花叶病毒（comovirus)增强子、编码多蛋白的核苷酸序列和一种或多种双生病毒 (geminivirus)扩增元件可操作地连接的第一调节区，并且编码双生病毒复制酶的第三核 酸被引入植物或植物的部分。一种或多种豇豆花叶病毒增强子可为豇豆花叶病毒UTR，例 如，豇豆花叶病毒高度翻译（CPMV-HT)UTR，诸如CPMV-HT 5'、3'UTR或其组合。一种或多种 双生病毒扩增元件可以选自大豆黄萎病病毒长基因间隔区（BeYDV LIR)和BeYDV短基因间 隔区（BeYDV SIR)。
[0024] 上文所述方法（方法A)也可涉及引入编码沉默阻抑蛋白（例如HcPro或pl9)的 另一核酸序列。
[0025] 上文所述方法（方法B)也可涉及还提供包含编码沉默阻抑蛋白（例如HcPro或 P19)的另一核酸序列的植物、植物的部分或植物细胞。
[0026]本发明也包括上文所述方法（A)，其中在引入步骤（步骤a)中，核酸在植物中瞬时 表达。可选地，在引入步骤（步骤a)中，核酸在植物中稳定地表达。
[0027] 上文所述方法（A)和（B)还可以包括收获植物和纯化PVLP的步骤。
[0028] 本发明包括组合物，其包含用于诱导免疫应答的有效剂量的上文所述的PVLP和 药学上可接受的载体。
[0029] 本发明也包括诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力的方法，包括向个体给 予上文所述的PVLP。PVLP可通过口服、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下的方式给予 个体。
[0030] 本发明也提供了包含通过上文所述的方法（A)和/或（B)产生的PVLP的植物物 质。植物物质可用于诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力。植物物质也可混合为食 品补充剂。
[0031] 发明概述部分未必描述了本发明的所有特征。
[0032] 附图简述
[0033] 本发明的这些和其他特征从参考附图中的以下描述会变得更清楚，其中：
[0034] 图1为小核糖核酸病毒基因组（肠病毒71)和多蛋白加工中间体的现有技术展示 (来自于ViralZone网页）。
[0035] 图2显示了 P1表达和由3⑶加工的Western印迹分析。将来自用上文鉴定的表 达载体转化的植物的10微克蛋白提取物上样，并在非还原条件下电泳。小鼠抗抗VP1单克 隆抗体用于免疫检测。比率指示用于转化的细菌悬浮液中P1 (构建体1300或1301，见表 1)与3Q)(构建体13KK1311或1315,见表1)农杆菌株（Agrobacterium)的比例。显示了 P1和VP1的预期位置。
[0036] 图3显示了针对VP1的最大化累积进行的3CD表达策略的筛选。将来自用上文 鉴定的表达载体转化的植物的5微克蛋白提取物上样，并在非还原条件下电泳。小鼠抗抗 VP1单克隆抗体用于免疫检测。比率指示用于转化的细菌悬浮液中P1 (1301)与3CD (1310、 131U1312和1313)农杆菌株的比例。
[0037] 图4显示了 EV71衣壳组装的评估。（A)对来自共表达P1和3⑶（构建体 1301+1310(4:0.5))的植物的蛋白提取物进行的尺寸排阻色谱（SEC)分离中得到的洗脱部 分的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和Western印迹分析。指示了考马斯亮蓝染色凝胶中推定 对应于VP1的条带。（B) SEC洗脱部分12的负染色透射电子显微镜检测。标尺代表100nm。
[0038] 图5显示了纯化的EV71PVLP的表征。（A)纯化的EV71PVLP的考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE和Western印迹分析。指示了考马斯亮蓝染色凝胶中推定对应于VP1的条带。另 外，也鉴定了分子量与其他EV71衣壳蛋白相对应的其他条带。（B)纯化的EV71的负染色透 射电子显微镜检测。在检测之前将样品以1/100稀释。标尺代表lOOnm。
[0039] 图6显不了通过电子显微镜进行的批号479-23-018的表征。
[0040] 图7显示了通过酶辅助的方法提取的、加工的并通过HIC选择的EV71 PVLP的冷 冻电子显微镜分析（批号479-31-020)。
[0041] 图8显示了通过机械提取方法（pH 8. 0)和热处理提取的EV71 PVLP的冷冻电子 显微镜分析（批号479-32-020)。
[0042] 图9A显示了来自于EV71株HK08的3CD，其包含如GenBank登录号ADG57603所 示的氨基酸1549-2193(SEQ ID N0:1)。图9B显示了来自于EV71株HK08的3CD，其包含如 GenBank登录号GQ279369所示的核苷酸5387-7321 (SEQ ID N0:2)。图9C显示了来自于 EV71株⑶FS08的3CD，其包含如GenBank登录号ACI25378所示的氨基酸1549-2193 (SEQ ID N0:3)。图9D显示了来自于EV71株⑶FS08的3CD，其包含如GenBank登录号FJ194964 所示的核苷酸5387-7321 (SEQ ID N0:4)。图9E显示了 P1氨基酸序列GenBank登录号 ADG57603(氨基酸1-862)(SEQ ID N0:5)。图9F显示了 P1核苷酸序列GenBank登录号 GQ279369(核苷酸743-3328)(SEQ ID N0:6)。图9G显示了来自于人肠病毒C血清型PV-1 的PVgpl多蛋白核苷酸序列（对基因组而言为GenBank登录号NC_002058,对多蛋白而言 为NP_041277:nt 5438-7369)(SEQ ID N0:7)。图9H显示了来自于脊髓灰质炎病毒的多蛋 白的氨基酸序列（氨基酸1566-2209,来自GenBank登录号NP_041277)(SEQ ID N0:8)。图 91显示了 PVgpl多蛋白的核苷酸序列[人肠病毒C](nt 743-3385,来自GenBank登录号 NC_002058)(SEQ ID N0:9)。图9J显示了多蛋白的氨基酸序列[人肠病毒C]GenBank登录 号 NP_041277(氨基酸 1-881，来自 GenBank 登录号 NP_041277)(SEQ ID N0:10)。
[0043] 发明详述
[0044] 以下描述优选实施方案。
[0045] 本发明涉及包含一种或多种小核糖核酸病毒结构蛋白的病毒样颗粒（VLP)(即小 核糖核酸病毒样蛋白或PVLP)，和在植