一种具有核糖核酸酶活性的蛋白质及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中一种具有核糖核酸酶活性的蛋白质及其制备方法与 应用。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase)的全名为聚合苷-a-寡核苷酸转移酶，是一 类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶。它对于调节RNA的代谢、转录后基因表达调控和 抵御病毒侵染等起到重要作用（CourtDL.etal.，2013)。已经报道的核酸酶种类很多， 例如研宄中常用的RNaseA对RNA有水解作用，可以用来消化DNA制品中的RNA;依赖于 2-5A系统的RNaseL可以特异性降解单链RNA(ZhouAetal.，1993)，来源于大肠杆菌的 RNaselll、酵母的Rntlp和PacI以及植物的Dicer等RNaselll家族酶具有特异切割双链 RNA的核糖核酸酶活性（CourtDL.etal.，2013)。研宄发现新型RNase对于认识生物体生 长发育调控和应用具有重要意义。
[0003] 病程相关蛋白（Pathogenesis-relatedprotein，PR)是由寄主植物编码的、多 种病原物以及化学药品或类似的胁迫而诱导表达积累的一类蛋白。PR蛋白现今有17个 家族（LiuandEkramoddoullah，2006)。在整个PR蛋白家族中，只有PR-10被推测具有 防御病毒的功能。PR-10蛋白在种子植物中以多基因家族形式存在，是受发育和环境调控 的。在双子叶植物中，PR-10在欧芹、豌豆、土豆、菜豆、大豆、芹菜和苜蓿中都有报道；在单 子叶植物中，芦笋、水稻、百合、高粱中也都有发现；在糖松，北美乔松，西部白松，花旗松， 海岸松，白云杉，山毛榉，桦树，桐油树这些树种中，也都发现了PR-10蛋白（Agarwaland Agarwal，2013)。不同来源的PR-10功能可能存在差异。一些PR-10蛋白，如CsPR10-l、 TcPR-10、AhPR-10、JcPR-10和SsPR-10都具有抗真菌和RNase活性，而来自桦树、羽扇豆和 棉属植物中的PR-10只有RNase活性。Park等人报道了CaPR-10蛋白RNase活性和抗病毒活 性之间的关系（Parketal.，2004)。AhPR-10突变体蛋白被尖孢镰刀菌（F.oxysporum)内 吞实验中，RNase活性域与真菌膜能够互作；变性的TcPR-10和JcPR-lOa会丧失RNase活性 和抗真菌活性（ChadhaandDas, 2006;Pungartniketal.，2009;Agarwaletal.，2013) 〇 但尚无具有体外切割双链RNA(dsRNA)活性植物PR-10的正式报道。
[0004] 在申请人前期研宄发现含有RNA4组分的甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV)侵染本生烟 可以诱导一种本生烟编码PR-10蛋白（NbPR-10)的mRNA急剧升高（Wuetal.，2014)的基 础上，利用基因工程技术建立一种NbPR-10蛋白制备方法，证明体外具有切割单链和双链 RNA的活性，其中体外具有切割双链RNA活性的PR-10尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有切割单链RNA和双链RNA活性的蛋白 质及其制备方法与应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了如下C1或C2的应用：
[0007] C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；
[0008] C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用；
[0009] 所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
[0010]a)氨基酸序列是SEQIDNo. 2所示的蛋白质；
[0011] b)在SEQIDNo. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0012] c)将SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有核糖核酸酶活性的蛋白质。
[0013] 其中，SEQIDNo. 2由160个氨基酸残基组成，是核糖核酸酶NbPR-10的氨基酸序 列。
[0014] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQIDNo. 2所示的蛋白质的氨基末端或羧 基末端连接上如表1所示的标签或GST标签（如pGEX-KG中携带的GST标签）。上述b)具 体可为在SEQIDNo. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接GST标签得到的融合蛋白。
[0015] 表1、标签的序列
[0016]
【主权项】
1. Cl或C2的应用： C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用； C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用； 所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质： a) 氣基酸序列是SEQ ID No. 2所不的蛋白质； b) 在SEQ ID No. 2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； c) 将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有核糖核酸酶活性的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质的相关生物材料为下述B1) 至B5)中的任一种： B1)编码所述蛋白质的核酸分子； B2)包含B1)所述核酸分子的表达盒； B3)包含B1)所述核酸分子的重组载体、或包含B2)所述表达盒的重组载体； B4)包含B1)所述核酸分子的重组微生物、或包含B2)所述表达盒的重组微生物、或包 含B3)所述重组载体的重组微生物； B5)包含B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或包含B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系、或包含B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3) 或4)所示的基因： 1) 其编码序列是SEQ ID No. 1的第1-483位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2) 核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子或cDNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA 分子或cDNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分子具有80%以上的同一性且编码所述蛋白质 的DNA分子或cDNA分子。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述核糖核酸酶具有切割单链 RNA和双链RNA活性。
5. 权利要求1所述的蛋白质的制备方法，包括将所述蛋白质的编码基因在生物细胞中 进行表达得到所述蛋白质。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下(1)或⑵或 ⑶或⑷所示的核酸分子： ⑴其编码序列是SEQ ID No. 1的第1-483位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； ⑵核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子或cDNA分子； ⑶在严格条件下与⑴或⑵限定的DNA分子或cDNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋 白质的DNA分子或cDNA分子； ⑷与⑴或⑵限定的DNA分子或cDNA分子具有80%以上的同一性且编码权利要求1所 述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为微生物细胞、植物细 胞或非人动物细胞。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述微生物细胞为细菌。
9. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：将所述蛋白质的编码基因在生 物细胞中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入所述生物细胞。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因通过含有所述蛋 白质的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞得到表达所述蛋白质的重组细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种具有核糖核酸酶活性的蛋白质及其制备方法与应用。本发明证明一种植物PR-10蛋白为具有体外切割单链RNA和双链RNA活性的核酸酶，该植物PR-10蛋白的下述用途属于本发明的保护范围：C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用。本发明所提供的蛋白质的制备方法，包括下述步骤1)和2)：1)制备表达所述蛋白质的重组生物细胞；2)表达所述重组生物细胞，得到所述蛋白质。实验证明，本发明提供的蛋白质的制备方法具有较强的实用性。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-70, C12N15-55, C12N9-22
【公开号】CN104593342
【申请号】CN201510043709
【发明人】韩成贵, 武文琦, 王颖, 姜宁, 范慧艳, 李大伟, 于嘉林, 张超, 王献兵, 张宗英, 张永亮
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月28日