一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病原检测技术，特别是涉及检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒和方 法。 技术背景
[0002] 小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病 是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产具有毁灭性危害，也是我国外来生物入侵研宄 的主要物种之一（王圆.小麦矮腥黑穗病菌[M].中国进境植物检疫有害生物选编，中华人 民共和国动植物检疫局和农业部植物检疫实验所编，北京：中国农业出版社，1997, 95? 98)。在小麦矮腥黑穗病流行年份引起的产量损失一般为20?50%，严重时可达75? 90%，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3?7年，包裹在菌瘿中的冬孢 子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个 国家将其列为检疫对象加以防范。我国从20世纪60年代开始一直将此病害列为一类对外 检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等在形态学上 极为相似，难于区别。
[0003] 传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性， 不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快 速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的理论意义和实用价值。1996年Ferreira等 (FerreiraM.A. ,TooleyP.ff. ,HatziloukasE.etc.Isolationofaspeciesspecific mitochondrialDNAsequenceforidentificationofTilletiaindica,theKarnal buntofwheatfungus[J].ApplicationEnvironmentMicrobiology,1996,62:87 ? 93)首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病（TilletiaindicaMitra)的鉴定中来，他们 选择了印度腥黑粉菌线粒体DNA的一个2.3kb的EcoRI片段进行了克隆和测序，设 计的特异性引物Til/Ti4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等 (Smith0.P. ,PetersonG.L.BeckR.J.etc.DevelopmentofaPCR-basedmethodfor identificationofTilletiaindica,causalagentofkarnalbuntofwheat[J]. Phytopathology, 1996, 86:115?122)通过克隆印度腥黑粉菌线粒体DNA的DraI片段， 进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Til7/Ml和Til7/M2,能分别从印度腥黑粉菌 中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。 2000 年Frederic等(FrederickR.D. ,SnyderK.E. ,TooleyP.ff.Identificationand DifferentiationofTilletiaindicaandT.walkeriusingthePolymeraseChain Reaction[J].Phytopathology, 2000, 90:951-960.)根据线粒体的差异设计了 5 对针对印 度腥黑粉菌的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，分别能将印度腥黑粉 菌菌株和黑麦草腥粉菌病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等（张竞宇，张正光，郑 小波，等.小麦印度腥黑穗病菌的分子检测[J].高技术通讯，2004, 1:31?36)利用核糖体 ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2,能将T.indica和 T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设 计了一对特异性引物M1/M2,可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR 技术，以便于提供更简单的鉴定方法。梁宏等（梁宏，彭友良，张国珍，等.腥黑粉菌属3种 检疫性真菌rDNA2IGS区的扩增及其序列分析[J].植物病理学报，2006,36(5):407-412) 依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑粉菌菌株从其近缘 属种中鉴别出来。2004年高强（高强.小麦矮腥黑穗病的分子检测[D].长沙，湖南农业大 学，2004)利用RAH)技术找到了一条可以将小麦网腥黑粉菌菌株和小麦矮腥黑粉菌菌株区 别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的 条带，没能将二者分开。2006年周业琴，刘素萍等（周业琴，刘素萍，周国梁，等.水稻腥 黑粉病菌的单孢检测[J]。植物检疫，2006, 20:38?41)应用核糖体ITS序列的通用引物 Till/Til4和两对特异性引物（Hor2/Hor9;Hml/Hm5)结合建立了套式PCR技术，可以将水 稻腥黑粉菌标定出来。本实验室陈万权、刘太国、刘建华利用AFLP技术，找到了小麦矮腥黑 粉菌的特异性片段，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘属种中区分开来，该技术已经获得国家 发明专利，专利号为：200510080073. 7,但未报道其检测的灵敏度，尚未在海关检疫中应用。 [0004] 酶联免疫检测方法，具有速度快，特异性好等优点，在病原菌检测中多有应用，但 是该技术的特异性和灵敏性依赖于采用的抗体一抗原之间的特异性识别及捕获性能，以及 影响胶体金显色的一些因素。具体在检测一种病原时，需要筛选或者制备得到特异性好的 单克隆抗体，并对影响因素进行调整才有可能获得好的特异性和灵敏性。
【发明内容】
[0005] 本发明基于酶联免疫检测技术，提供一种适用于检测矮腥黑粉菌的单克隆抗体， 以及依赖该抗体的特异性好，灵敏度高的检测方法和试剂盒。具体方案如下：
[0006] 一株杂交瘤细胞，其特征在于：用于分泌对小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversaKUhn)的单克隆抗体，名称为：F-2-1,其保藏号为CGMCCNo. 9714。
[0007] -种对小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)的单克隆抗体，其特征在 于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞所分泌。
[0008] 所述单克隆抗体在检测小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)或者检测 小麦矮腥黑穗病中的用途。
[0009] -种检测小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn)的试剂盒，包括试纸条 和微孔板，
[0010] 所述试纸条包括底板、样本吸收垫、反应膜和吸水垫；所述样本吸收垫、反应膜、吸 水垫依次黏贴安装在所述底板上；
[0011] 其特征在于：所述微孔板的微孔中有冻干的微孔试剂，所述微孔试剂指胶体金标 记权利要求2所述的单克隆抗体而得的金标抗体；
[0012] 所述反应膜分为检测区和质控区，所述检测区包被有小麦矮腥黑粉菌多克隆抗 体，所述质控区包被有抗抗体。
[0013] 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
[0014] -种检测小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于采用上述试剂盒对待测物进行检 测，其步骤如下：
[0015] (1)制备待测样本溶液
[0016] (2)向所述微孔中滴加样本溶液，混勾，将所述试纸条上对应样本吸收垫的一端插 入微孔中并接触到其中的微孔试剂，读取所述试纸条的检测结果判断待测样品是否含有小 麦矮腥黑粉菌。
[0017] 所述待测物为疑似携带小麦矮腥黑粉菌的小麦植株或其组织，所述制备待测样本 溶液指：取小麦植株或其组织5g放入10mLPBS缓冲溶液中，并加入终浓度为质量体积百分 比0. 2%的助溶剂聚乙二醇2000,超声提取5-10分钟，取上清。
[0018] 上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0019] (1)准备对小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体及多克隆抗体
[0020] (2)制备微孔试剂，样本吸收垫、反应膜和吸水垫，
[0021] (3)将样本吸收垫，反应膜和吸水垫依次黏贴安装在底板上；
[0022] 其特征在于制备微孔试剂包括如下几部分：
[0023] 胶体金溶液：在100ml质量百分比为0.01%的氯金酸水溶液中，加入1.5ml 1%的 柠檬酸三钠溶液，加热搅拌冷却得胶体金溶液；
[0024] 准备小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物：在磁力搅拌下，在所述胶体金 溶液中加入〇. 2mol/L碳酸钾调pH值至7. 2,按lml胶体金加60yg抗体的标准向胶体金溶 液中加入所述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA至BSA在 胶体金溶液中的终浓度为体积百分含量为1%，静置30min;12000rpm、4°C离心30min，弃 上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液重悬沉 淀，得到的小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物溶液，置4°C备用；
[0025] 所述复溶缓冲液：pH7. 2,含牛血清白蛋白、吐温-20的0. 05mol/L磷酸盐溶液，其 中牛血清白蛋白的终浓度为体积百分含量0. 05-0. 10%，吐温-20的终浓度为质量百分含 量 0? 05%;
[0026] 微孔试剂：向微孔板的微孔中加入50y1所述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体 金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为_70°C条件下，预冻4h