后，再冻干14h，得到冻干 有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
[0027] 所述反应膜为醋酸纤维素膜，所述制备反应膜的工艺如下：
[0028] 用pH为7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲液将小麦矮腥黑粉菌多克隆抗体稀释到 lmg/mL，按照0. 8y1/cm2的量包被，用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的检测区；用 0? 01mol/L、pH7. 4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到lmg/ml，按照0? 8y1/cm的量包被， 用点膜仪将其包被于醋酸纤维素膜上的质控区，将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥 10h，备用。
[0029] 所述制备样本吸收垫指将样本吸收垫置于pH为7. 2,含体积百分含量0. 5 %牛血 清白蛋白的〇. 〇2mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡，37°C烘2h备用。
[0030] 本发明提供用于检测小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，基于该单克隆抗体的对小麦 矮腥黑粉菌的胶体金试纸条、检测方法以及试纸条的制备方法。
[0031] 将小麦叶锈菌、小麦条锈菌用pH为7. 2、0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用试 纸条进行检测，结果显示小麦叶锈菌、小麦条锈菌50mg/L浓度时，试纸条检测区不显色，呈 阴性，可以得出试纸条未对这些相似病菌发生交叉反应，即对小麦矮腥黑粉菌具有特异性。 本发明提供的试纸条具有对小麦矮腥黑粉菌的特异性，该试纸条的检测限能到lOmg/L[0032] 基于本发明所提供的单克隆抗体对小麦矮腥黑粉菌所具有的良好的特异性，该单 克隆抗体还可以用于基于酶联免疫反应原理的其它方法。
[0033] 杂交瘤细胞保藏信息：
[0034] 生物材料名称：F-2_1
[0035] 分类命名：对小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体杂交瘤细胞株
[0036] 保藏日期：2014年9月29日
[0037]保藏号：CGMCC No. 9714 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0038] 图1本发明试纸条的结构剖示图
[0039] 图2本发明试纸条的俯视图
[0040] 图3本发明试纸条所显示的各种检测结果
【具体实施方式】
[0041] 实施例1.测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的制备
[0042] 检测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的构成
[0043] 一、微孔试剂
[0044] 微孔上具有微孔塞；微孔底部冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记 物，冻干量50y1;
[0045] 二、试纸条（图1):
[0046] 所述试纸条是由底板、样本吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；
[0047] 所述样本吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上， 样本吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样本吸收垫的始端与底板 的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
[0048] 所述试纸两端黏贴有保护膜。
[0049] 保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样本吸收垫上的检测端，在 检测端保护膜上应有MAX字样（图2)。
[0050] 所述反应膜上有检测区4和质控区5,检测区和质控区均为与所述试纸条的长相 垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记线的保护膜的一侧，质控区位于远离所述有MAX 标记的保护膜的一侧。检测区包被有小麦矮腥黑粉菌是多克隆抗体，质控区包被有羊抗鼠 抗抗体。
[0051] 底板为PVC底板；样本吸收垫为玻璃纤维；吸水垫为吸水纸；反应膜为醋酸纤维素 膜；保护膜为PE材质保护膜。
[0052] 检测小麦矮腥黑粉菌胶体金试纸的制备方法
[0053] 该试纸的制备方法主要包括如下步骤：
[0054] 1)制备冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
[0055] 2)制备具有小麦矮腥黑粉菌的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；
[0056] 3)将2)制备好的反应膜与样本吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
[0057] 4)将1)小麦矮腥黑粉菌金标抗体微孔试剂进行封装，将3)试纸组装：反应膜贴 于底板上，然后再依次贴上样品垫、吸水垫和保护膜，最后剪切成条即可，如图1所示。
[0058] 下面分步详细叙述：
[0059]( -）各部件的制备
[0060] 1.小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体的制备
[0061]a?动物免疫
[0062] 选取6-8周龄健康Balb/c小鼠，按照免疫剂量为200yg/只进行皮下多点注射免 疫。首次免疫时取等量弗氏完全佐剂（购自Sigma公司，货号F5881)与免疫原（TCK1冬孢 子）均匀混合，后续免疫时与等量弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司，货号F5506)混合。
[0063] b.细胞融合和克隆化
[0064] 采用间接竞争ELISA法测定小鼠血清的效价，包被原稀释1000倍，当血清测定效 价高于3000时，取其脾细胞，按9:1比例（数量比）与SP2/0骨髓瘤细胞（购自中国遗传 与发育生物学研宄所）融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限 稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0065] 经筛选得到小麦矮腥黑粉菌的小鼠杂交瘤细胞株F-2-1。该杂交瘤细胞株于2014 年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，中国，北京）， 保藏号为CGMCCNo. 9714。该杂交瘤细胞株分泌的抗体针对黑粉菌特异性良好，灵敏度能达 到 5mg/L。
[0066]c.细胞冻存和复苏
[0067] 将黑粉菌杂交瘤细胞株F-2-1用冻存液制成1X106个/ml的细胞悬液，在液氮中 长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶 内培养。
[0068]d?单克隆抗体的制备与纯化
[0069] 将杂交瘤细胞株F-2-1置于pH7. 4，含有20 %小牛血清和0.2 %碳酸氢钠的 RPMI-1640培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行 纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。
[0070] 2.多克隆抗体的制备
[0071] 采用新西兰大白兔（购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂）作为免疫动物，以 黑粉菌作为免疫原，免疫剂量为1. 5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐（来源同 上）混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3?4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不 完全佐剂（来源同上）混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一 次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到多克隆 抗体。
[0072] 3.羊抗鼠抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊 进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0073] 4.小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0074] (1)胶体金的制备
[0075] 用双蒸去离子水将1%氯金酸（购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成 0. 01% (质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml〇.〇1 %氯金酸加入 1. 5ml1%柠檬酸三钠（购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续搅拌加热 反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、 无沉淀和漂浮物。
[0076] (2)小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0077] 在磁力搅拌下，用0? 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 2,按60yg抗体/ml胶 体金的标准向胶体金溶液中加入上述小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体，继续搅拌混勾30min, 加入10%BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量），静置30min。 12000rpm、4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体 积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物溶 液，置4°C备用。
[0078] 复溶缓冲液：含牛血清白蛋白、吐温-20的0. 05mol/L、pH7. 2的磷酸盐溶液，其中 牛血清白蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0. 05-0. 10% (体积百分含量），吐温-20在复溶 缓冲液中的终浓度为0.05% (质量百分含量）。
[0079] 5.将小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
[0080] 向微孔试剂微孔板（96孔酶标板可拆式，深圳金灿华公司）中加入50y1小麦矮 腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70°C条件下，预冻 4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体-胶体金标记物的微 孔试剂，封装待用。
[0081] 6.样本吸收垫的准备：将样本吸收垫置于含0. 5% (体积百分含量）牛血清白蛋 白、pH为7. 2、0. 02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡，37°C烘2h备用。
[0082] 7.反应膜的制备
[0083] 包被过程：用pH为7. 2、0.Olmol/L磷酸盐缓冲液将小