专利名称：一种辅助鉴定抗黄矮病小麦的方法及其专用引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定抗黄矮病小麦的方法及其专用引物对。
背景技术：
小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(BYDV)引起的小麦主要病毒病，一旦 感染即无药可治，造成小麦严重减产。近年来，由于气候条件的改变，传播大麦黄矮病毒的 麦蚜在我国广泛发生、日益严重，小麦黄矮病有从山西、甘肃、陕西等主发区向江淮和西南 麦区蔓延扩散的趋势。因此，选育抗黄矮病小麦新品种，是防治该病害的最经济有效途径。优良可利用的抗病基因是抗病育种的前提。迄今，小麦初级基因库中尚未发现真 正有效的抗性基因。然而，小麦近缘植物一中间偃麦草高抗或免疫大麦黄矮病毒的多个 株系，作为重要抗源得到应用和深入研究。中间偃麦草至少含有3个抗黄矮病基因，分别 位于第7同源群染色体7Ai#l长臂、7E长臂和第2同源染色体2Ai-2短臂上。科学家通 过小麦与中间偃麦草远缘杂交，育成抗黄矮病的部分双二倍体TAF46，又以TAF46做桥梁 亲本，育成抗黄矮病的二体附加系L1 (附加2条7Ai#l染色体)以及7Ai#lL双端体附加 系，继之，以L1为抗源，利用中国春ph突变体诱导部分同源染色体配对和组织培养两条途 径，将7Ai#l染色体上的抗黄矮病基因成功地导入小麦，育成一批抗黄矮病易位系，包括 YW642 (HW642)、YW443、YW243 (Xin, Z.，Zhang, Z.，Chen, X.，Lin, Z.，Ma, Y.，Xu, H.，Banks, P.，and Larkin, P. Development and characterization ofcommon wheat-Thinopyrum intermedium translocation lines with resistance tobarley yellow dwarf virus. Euphytica. 2001，119 :161_165 ；张增艳、辛志勇、陈孝等，抗黄矮病小麦新品系YW443的分 子细胞遗传学鉴定，遗传学报，2000, 27 (7) 614 620 ；张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物 技术育种研究进展，作物杂志，2005，5 4-7)，以及TC5-TC10、TC14等(Banks, P.，Larkin， P. , Bariana, H. , Lagudah, E. , Appels, R. , ffaterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, X. , Xu, H. , Xin, Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38:395-405)。基因组原位杂交(GISH)、分子标记的快速发展为鉴定外源染色体、定位外源基因 提供了有力工具。利用GISH、RFLP标记等技术，鉴定出具Bdv2的小麦-中间偃麦草易位系 TC5-TC10、TC14 (Banks，P. , Larkin, P. , Bariana, H. , Lagudah, E. , Appels, R.，Waterhouse， P，，Brettell，R.，Chen，X.，Xu, H，，Xin, Z.，Qian, Y.，Zhou，M.，Cheng，Z.，and Zhou，G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resi stance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 395~405) 以及 YW642、YW443、YW243(张增艳，辛志勇，马有志等，Mapping of a BYDV resistance gene from Thintermedium intermedium in wheat background by molecular markers， Sci ence in China (SeriesC)，1999，42 (6) :663_668，张增艳、辛志勇、陈孝等，抗黄矮病小 麦新品系YW443的分子细胞遗传学鉴定，遗传学报，2000，27 (7) 614 620 ；谢皓，陈孝，张增艳，辛志勇，林志珊，杜丽璞，马有志，徐惠君，抗黄矮病小麦新品系YW243的选育和细胞 分子生物学鉴定，作物学报，2000，26 (6) 687-691 ；Xin, Z.，Zhang, Ζ.，Chen, X.，Lin, Ζ.， Ma, Y. , Xu, H. , Banks, P. , and Larkin, P. Development and characterization of common wheat-Thinopyrum intermedium translocation lines with resistance to barley yellow dwarf virus. Euphytica. 2001,119 :161-165)，发现携带抗黄矮病基因 Bdv2 的中间 偃麦草染色体7Ai#l长臂(7Ai#lL)端部小片段易位到小麦染色体7D长臂端部(张增艳，辛 志勇，马有志等，Mapping of a BYDV resistancegene from Thintermedium intermedium in wheat background by molecular markers,Science in China (Series C),1999,42 (6) 663-668)。研究发现，携带抗黄矮病基因Bdw2的小麦-中间偃麦草易位系YW642、YW443、 YW243, TC14等，高抗黄矮病，可以作为小麦抗黄矮病育种的重要抗源。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定抗黄矮病小麦的方法及其专用引物对。本发明提供的辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的方法，包括如下步骤以待测小 麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引 物对进行PCR扩增；如果得到1016bp的DNA片段，待测小麦为候选的携带TiSTKl基因的小 麦；如果没有得到1016bp的DNA片段，待测小麦为候选的不携带TiSTKl基因的小麦；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病 相关蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮 病抗性相关蛋白的DNA分子。所述PCR 扩增的程序如下94°C 3min ； 94°C 45s，68°C 35s, 72 °C 45s_lmin30s， 5 个循环；94 "C 45s, 66 "C 35s, 72 "C 45s_lmin30s，5 个循环；94 "C 45s, 64 "C 35s, 72°C 45s-lmin30s，25个循环；72°C IOmin0所述PCR扩增的程序具体如下94°C 3min ； 94°C 45s, 68 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 个循环；94°C 45s, 66 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 个循环； 94°C 45s，64°C 35s，72°C lmin30s，25 个循环；72°C IOmin0本发明还保护一种辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的方法，包括如下步骤以待 测小麦的cDNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物 对进行PCR扩增；如果得到512bp的DNA片段，待测小麦为候选的携带TiSTKl基因的小麦； 如果没有得到512bp的DNA片段，待测小麦为候选的不携带TiSTKl基因的小麦；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病 相关蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮 病抗性相关蛋白的DNA分子。所述PCR 扩增的程序如下94 °C 3min ；94 °C 45s_lmin30s，68 °C 35s, 72 °C 45s-lmin30s，5 个循环；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 个循环；94°C 45s, 64 °C 35s, 72 °C 45s-lmin30s, 25 个循环；72 °C lOmin。所述 PCR 扩增程序具体如下 94°C 3min ；94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s，5 个循环；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s，5 个循环； 94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s, 25 个循环；72°C lOmin。以上两种方法中，PCR扩增采用的引物对相同，但因为模板分别为基因组DNA或 cDNA，所以扩增片段的大小有差异。所述待测小麦具体可为抗黄矮病的二体附加系L1、抗黄矮病的双端体系7Ai#lL、 抗黄矮病易位系YW642、抗黄矮病易位系YW443、抗黄矮病易位系YW243、抗黄矮病易位系 TC14、中8601、中国春、YW641S、抗黄矮病的小麦-中间偃麦草附加系Z1或PmV。本发明还保护序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。所述引物对可用于制备辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的试剂盒；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病 相关蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮 病抗性相关蛋白的DNA分子。本发明还保护一种辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的试剂盒，包括所述引物对；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5，末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病 相关蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮 病抗性相关蛋白的DNA分子。所述方法所述引物对或所述试剂盒可用于辅助鉴定抗黄矮病小麦；携带TiSTKl 基因的小麦为候选的抗黄矮病小麦；不携带TiSTKl基因的小麦为候选的感黄矮病小麦。抗 病性鉴定分级采用小麦黄矮病严重度的国内标准，即IT的标准，0-3为抗黄矮病小麦，6-8为感黄矮病小麦。所述方法，所述引物对或所述试剂盒可用于小麦育种。本发明的引物对和方法基于源于中间偃麦草的，小麦-中间偃麦草易位系YW642 共有的抗黄矮病重要基因TiSTKl的核苷酸序列(1822bp)。本发明成功地研发出抗黄矮病 重要基因TiSTKl的As-PCR标记。携带TiSTKl基因的小麦为候选的抗黄矮病小麦。应用 本发明的方法，准确性高，可以实现早期筛选，节省时间和资源，对于抗黄矮病小麦育种具 有重大意义。
图1为实施例2的电泳图。图2为实施例3的电泳图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。中间偃麦草(Ti)购自中国农业科学院作物科学研究所资源种质库，编号为 Z1146。中8601 购自中国农业科学院作物科学研究所。中国春购自中国农业科学院作物科学研究所。大麦黄矮病病毒(BYDV-GAV株系)购自中国农业科学院植物保护研究所。抗黄矮病易位系YW642(HW642)参考文献张增艳，马有志，辛志勇等，1998，应 用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质，中国农业科学，31 (3) 1-4 ；Zhang Z， Xin Z，Ma Y，Chen X，Xu Q，Lin Z. 1999，Mapping of a BYDV resistance gene from Thinopyrum intermedium in wheat background by molecular markers. Sci China C Life Sci.42(6) :663_668.；该易位系是1991年中国农业科学院作物科学研究所辛志勇等 创制，张增艳等1996年鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供。抗黄矮病易位系YW443 参考文献张增艳、辛志勇、陈孝等，抗黄矮病小麦新品系 YW443的分子细胞遗传学鉴定，遗传学报，2000，27 (7) :614 620 ；该易位系是1991-1995 年中国农业科学院作物科学研究所辛志勇等创制，张增艳等1998-1999年鉴定出来；中国 农业科学院作物科学研究所小麦分子育种组有保存；中国农业科学院作物科学研究所保证 向公众提供。抗黄矮病易位系YW243 参考文献谢皓，陈孝，张增艳，辛志勇，林志珊，杜丽璞， 马有志，徐惠君，抗黄矮病小麦新品系YW243的选育和细胞分子生物学鉴定，作物学报， 2000,26(6) 687-691 ；该易位系是1991-1995年中国农业科学院作物科学研究所辛志勇等 创制，谢皓等1998-1999年鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供。TC14=Banks, P.，Larkin, P.，Bariana, H.，Lagudah, Ε. , Appels, R. , Waterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, Χ. , Xu, H. , Xin, Ζ. , Qian, Y. , Zhou, Μ.,
7Cheng,Z. ,and Zhou,G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 :395_405 ；该易位系是1991-1994年澳大利亚科学家Banks，Larkin与中 国科学家辛志勇、陈孝、徐惠君等创制，Banks, Larkin，等1995年鉴定出来；中国农业科学 院作物科学研究所引进、有保存；中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供。抗黄矮病的二体附加系L1 参考文献:Cauderon, Y.，Saigne，B.，and Dauge， M. (1973)The resistance to wheat rusts of Agropyron intermedium and its use inwheat improvement. Proc Int Wheat Genet Symp Wheat Improvement,Vol. 4,E. R. Sears and L. M. S. Sears eds(Univ of Missouri, Columbia, MD), pp 401-407 ;L1 是 1973 年由法 国科学家Cauderon等创制；中国农业科学院作物科学研究所引进、有保存；中国农业科学 院作物科学研究所保证向公众提供。抗黄矮病的双端体系7Ai#lL 参考文献Banks，P.，Larkin, P.，Bariana, H.， Lagudah, E. , Appels, R. , ffaterhouse, P. , Brettell, R. , Chen, X. , Xu, H. , Xin, Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cell culture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995,38 :395_405 ；该易位系是 1991-1994 年澳大利亚科 学家Banks，Larkin与中国科学家辛志勇、陈孝、徐惠君等创制，Banks, Larkin，等1995年 鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所引进、有保存；中国农业科学院作物科学研究 所保证向公众提供。YW641S 参考文献Xiaodong Liu, ZengYan Zhang(通讯作者)，Zhiyong Xin, 2005, Molecular evidence of barley yellow dwarf virus replication/movement suppressed by the resistance gene Bdv2 derived from Th. intermedium, Journal of Genetic and Genomics (Yi Chuan Xue Bao) ,932 942-947 ；
是1996-1998年中国农业科学院作物科学研究所张增艳等选育、鉴定出来；中国农业科学 院作物科学研究所小麦分子课题组(张增艳研究员)保存；中国农业科学院作物科学研究 所保证向公众提供。PmV 参考文献:Li H, Chen X，Xin Z Y, Ma Y Z, Chen X Y, Jia X. Development and identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL. 6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew. Plant Breeding, 2005,124 :203_205 ; 该系是1997-2001年中国农业科学院作物科学研究所科学家陈孝、辛志勇等创制，李辉等 鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所小麦分子课题组有保存；中国农业科学院作物 科学研究所保证向公众提供。抗黄矮病的小麦-中间偃麦草附加系Z1 (携带Bdv4)参考文献Bmks，P.， Larkin，P.，Bariana, H.，Lagudah, E.，Appels, R.，Waterhouse, P.，Brettell，R.，Chen， X.，Xu, H.，Xin, Z.，Qian, Y.，Zhou，M.，Cheng，Z.，and Zhou，G. The use of cell culture for sub—chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995，38 :395_405 ；Zhang，Z.Y.，Xin, Z. Y.， and Larkin，P.J.2001. Molecular characterization of a Thinopyrum intermedium group 2chromosome (2Ai_2)conferring resistance to barley yellow dwarf virus.Genome, 44 1129-1135 ；Zl是在小麦基因组中附加了 1对中间偃麦草染色体2Ai_2，后者携 带抗黄矮病基因Bdv4，由澳大利亚科学家Banks，Larkin与中国科学家辛志勇、陈孝、徐惠 君等于1992-1995年创制、鉴定，中国农业科学院作物科学研究所有保存；中国农业科学院 作物科学研究所保证向公众提供。实施例1、引物对的发现利用抗黄矮病重要基因(TiSTKl)cDNA序列设计的一对引物，对抗黄矮病材料 (Ti、YW642)、感黄矮病小麦cDNA的扩增序列所获得的62个STK基因cDNA克隆的序列 测定和比对分析，发现中间偃麦草中有3个转录本，其中2个位于易位到抗病小麦的小 麦7D染色体的中间偃麦草7Ai#lL上，其中这个引物对即是易位到抗病小麦中的中间偃 麦草TiSTKl基因序列，另外感病小麦中有很高同源性的序列，并发现二者在5 ‘非编码区 存在2个连续的单核苷酸多态性(SNPs)差异，将这2个连续的碱基差异设计为上游引物 TISTK1-ASF的3’端，然后利用PRIMER5引物设计软件设计出与上游引物匹配的下游引物 TISTK1-ASR，即本发明的引物对。用本发明的引物对进行扩增，如果得到与序列1中对应的 片段，该小麦为抗病材料，因为TiSTKl基因位于含Bdv2的中间偃麦草染色体7Ai#lL上，这 段染色体与小麦的难以交换，因此只要携带Bdv2的抗病小麦易位系、中间偃麦草、抗病小 麦杂交材料均可以扩增出该特异带，而感病小麦和携带PmV的抗白粉病小麦均不能扩增。TISTKI-ASF :5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCTTC-3，(序列 3)；TISTKI-ASR :5，-TGAGTATCTCCGTCGGATGAGTTGG-3，(序列 4)。实施例2、应用引物对辅助鉴定抗黄矮病小麦应用实施例1设计的引物对(由TISTK1-ASF和TISTK1-ASR组成的引物对)检测 如下样本抗黄矮病的中间偃麦草(Ti)；抗黄矮病的二体附加系Ll ；抗黄矮病的双端体系 7Ai#lL ；抗黄矮病易位系YW642 (HW642)、YW443和YW243，以上抗黄矮病材料均携带TiSTKl 基因；中8601 (感黄矮病小麦)；中国春(CS ；感黄矮病小麦)；YW641S(YW642的感病姊妹 系)。一、抗病性鉴定分别种植上述生物材料(每份材料种植60株)，在苗期接种黄矮病病毒 (BYDV-GAV株系)的蚜虫。镊取携带BYDV-GAV的蚜虫置于小麦或中间偃麦草的植株上，每 株约10只蚜虫，接种30-40天后调查上述生物材料对黄矮病抗性。抗病性鉴定分级采用小麦黄矮病严重度的国内标准，即IT的标准，见表1，参考文 献“李光博，曾士迈，李振歧主编.小麦病虫草鼠害综合治理[M].北京中国农业科技出 版社，1990”。表1小麦黄矮病严重度分级标准 结果表明Ti、Ll、7Ai#lL、YW642(HW642)、YW443 和 YW243 对 BYDV-GAV 株系侵染表 现高抗，它们对小麦黄矮病严重度为0，即都为健株；小麦品系中8601冲国春(CS)、YW641S 对小麦BYDV-GAV株系侵染表现感病，其黄矮病严重度为6-8级。二、应用引物对辅助鉴定1、提取各个生物材料叶片的基因组DNA(gDNA)。2、以基因组DNA为模板，用TISTK1-ASF和TISTK1-ASF TISTK1-ASR组成的引物对 进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR 扩增体系ddH2017. 3ii 1，10XPCR Buffer 2. 5 u l,25mM MgCl2l. 5u 1, 2. 5mMdNTP mix 1. 5u 1, TISTK1-ASF (10 u M) 0. 5 u 1，TISTK1-ASR(10 u M) 0. 5 u 1, lOOng/uL gDNA 1 u 1, rTaq(5U/u 1)0. 2uPCR 扩增程序:94°C 3min ；94°C 45s，68°C 35s, 72°C lmin30s, 5 个循环；94°C 45s, 66 °C 35s, 72 °C lmin30s，5 个循环；94 °C 45s, 64 °C 35s, 72 °C lmin30s，25 个循环； 72°C lOmin。3、将PCR扩增产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳。结果见图1。中间偃麦草、抗黄矮病的二体附加系L1、抗黄矮病的双端体系7Ai#lL 以及抗黄矮病易位系的小麦材料中均可以扩增出一条抗病特异带(1016bp)；没有携带 TiSTKl基因的感病小麦材料不能扩增出该特异带。4、分别将各个PCR扩增产物进行测序中间偃麦草、抗黄矮病的二体附加系L1、抗黄矮病的双端体系7Ai#lL以及抗黄矮 病易位系的小麦材料中均可以扩增出一条抗病特异带(1016bp)，且该特异带的序列均如序 列表的序列1自5，末端第52-1067位核苷酸所示(序列1所示DNA为TiSTKl基因的基因 组序列)。说明该扩增带可以作为该TiSTKl基因特异的PCR标记。三、抗病性与TiSTKl基因的跟踪对有特异扩增带的抗病株的下一代植株的抗病性进行跟踪。结果表明，利用该发明的TISTK1-ASF与TISTK1-ASR引物进行PCR扩增，凡是基因组DNA能够扩增出1016bp的 特异序列的待测植株均为含TiSTKl抗病单株。因此，利用本发明的引物对，根据该特异性 条带，可以鉴定出测试植株中抗黄矮病重要基因TiSTKl的有无，辅助选择抗黄矮病单株， 用于辅助选育抗黄矮病小麦新品系(种)；另外，利用该发明的TiSTKl特异的功能标记辅 助选择，无需每代都进行人工接种、进行抗病鉴定，有利于开展育种加代、实现一年2-3代 的育种程序，缩短抗黄矮病小麦育种的周期，加快育种进程。实施例3、应用引物对辅助鉴定抗黄矮病小麦应用实施例1设计的引物对(由TISTK1-ASF和TISTK1-ASR组成的引物对)检测 如下样本抗黄矮病的二体附加系L1 ；抗黄矮病的双端体系7Ai#lL;抗黄矮病易位系 YW642 (HW642)、YW443、YW243和TC14 ；中8601 (感黄矮病小麦)；抗黄矮病的小麦_中间偃 麦草附加系Z1 (携带Bdv4 ；抗黄矮病)、PmV (携带PmV ；抗白粉病；感黄矮病)。一、抗病性鉴定方法同实施例2的步骤一。结果表明Ll、7Ai#lL、YW6420W642)、YW443、YW243、TC14*Z1 对 BYDV-GAV 株系 侵染表现高抗，它们对小麦黄矮病严重度为0，即都为健株；中8601和PmV对小麦BYDV-GAV 株系侵染表现感病，其黄矮病严重度为6-8级。二、应用引物对辅助鉴定1、提取各个生物材料叶片的RNA，反转录为cDNA。2、以cDNA为模板，用TISTK1-ASF和TISTK1-ASR组成的引物对进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物。PCR 扩增体系ddH20 17. 3u 1,10XPCR Buffer 2. 5 u l,25mM MgCl2 1. 5u 1, 2. 5mMdNTP mix 1. 5 u 1, TISTK1-ASF (10 u M)0. 5 u 1, TISTK1-ASR (10 u M)0. 5 u 1, cDNAl u 1，rTaq (5U/ ii 1) 0. 2 ii 1。PCR 扩增程序94 °C 3min ；94 °C 45s, 68 °C 35s, 72 °C 45s，5 个循环；94 °C 45s, 66°C 35s，72°C 45s，5 个循环；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s, 25 个循环；72°C lOmin。同时，以保守的小麦看家基因(18SrRNA，F :5，-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3，，R 5，-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3，)作为内标基因使样品间总cDNA浓度保持一致。3、将PCR扩增产物进行1 %的琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。Ll、7Ai#lL、YW642 (HW642)、YW443、YW243 和 TC14 均扩增得到 512bp 的特异条带，Z1、中8601和PmV没有得到该条带。4、分别将各个PCR扩增产物进行测序抗黄矮病的二体附加系L1、抗黄矮病的双端体系7Ai#lL以及抗黄矮病易位系的 小麦材料中均可以扩增出一条抗病特异带(512bp)，且该特异带的序列均如序列表的序列 2自5，末端第53-564位核苷酸所示(序列2所示DNA为TiSTKl基因的cDNA序列)。TiSTKl基因仅在携带Bdv2基因的抗黄矮病的二体附加系L1、抗黄矮病的双端体 系7Ai#lL以及抗黄矮病易位系中表达；在没有携带TiSTKl基因的感黄矮病小麦材料、抗黄 矮病的Z1和抗白粉病的PmV(携带PmV)中均不表达。说明TiSTKl是携带Bdv2的抗黄矮 病材料特异表达的基因。上述结果进一步证明本发明的引物对(As-PCR标记)可以辅助选
11择抗黄矮病基因TiSTKl与Bdv2，从而辅助鉴定和选择抗黄矮病小麦材料。
权利要求
一种辅助鉴定携带TiSTK1基因的小麦的方法，包括如下步骤以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增；如果得到1016bp的DNA片段，待测小麦为候选的携带TiSTK1基因的小麦；如果没有得到1016bp的DNA片段，待测小麦为候选的不携带TiSTK1基因的小麦；所述TiSTK1基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病相关蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物黄矮病抗性相关蛋白的DNA分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的程序如下94°C3min ； 94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 个循环；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 个循环；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s_lmin30s，25 个循环；72°C lOmin。
3.一种辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的方法，包括如下步骤以待测小麦的cDNA 为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩 增；如果得到512bp的DNA片段，待测小麦为候选的携带TiSTKl基因的小麦；如果没有得到 512bp的DNA片段，待测小麦为候选的不携带TiSTKl基因的小麦；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病相关 蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮病抗 性相关蛋白的DNA分子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的程序如下94°C3min； 94°C 45s，68°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 个循环；94°C 45s，66°C 35s，72°C 45s_lmin30s，5 个循环；94°C 45s，64°C 35s，72°C 45s_lmin30s，25 个循环；72°C lOmin。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述待测小麦为抗黄矮病的二 体附加系L1、抗黄矮病的双端体系7Ai#lL、抗黄矮病易位系YW642、抗黄矮病易位系YW443、 抗黄矮病易位系YW243、抗黄矮病易位系TC14、中8601、中国春、YW641S、抗黄矮病的小 麦_中间偃麦草附加系Z1或PmV。
6.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。
7.权利要求6所述引物对在制备辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的试剂盒中的应用；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病相关 蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮病抗 性相关蛋白的DNA分子。
8.一种辅助鉴定携带TiSTKl基因的小麦的试剂盒，包括权利要求6所述引物对；所述TiSTKl基因是如下1)至6)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第171至1448位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5，末端第674至2032位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列1所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物抗黄矮病相关 蛋白的DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物黄矮病抗 性相关蛋白的DNA分子。
9.权利要求1至6中任一所述方法，权利要求6所述引物对或权利要求8所述试剂盒 在辅助鉴定抗黄矮病小麦中的应用；携带TiSTKl基因的小麦为候选的抗黄矮病小麦，不携 带TiSTKl基因的小麦为候选的感黄矮病小麦。
10.权利要求1至5中任一所述方法，权利要求6所述引物对或权利要求8所述试剂盒 在小麦育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定抗黄矮病小麦的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤以待测小麦的基因组DNA(或cDNA)为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增；如果得到1016bp(或512bp)的DNA(或cDNA)片段，测试小麦即为候选的携带TiSTK1基因的抗黄矮病小麦；如果没有得到1016bp(或512bp)的PCR扩增片段，测试小麦为候选的不携带TiSTK1基因的感黄矮病小麦。应用本发明的方法，准确性高，可以实现早期筛选，节省时间和资源，对于抗黄矮病小麦育种具有重大意义。
文档编号C12N15/11GK101892315SQ201010226688
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者张增艳, 辛志勇, 陈亮, 高兰英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所