专利名称：用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测用基因芯片和试剂盒，尤其涉及检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒。
背景技术：
食品质量与食品安全关系人类健康，因而受到世界各国的高度重视。微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。细菌污染造成的食源性疾病(食物中毒)是我国食品安全中最突出的问题。据卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，中毒6237 人，死亡135人；2001年共发生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，116人死亡。2005 年全国各地上报的食物中毒事件中，微生物食物中毒人数最多，占总数的43.0%。国家食源性疾病监测网个案报告的资料分析表明微生物性病原占46. 4%，微生物性食源性疾病暴发中，副溶血性弧菌导致的疾病暴发占40. 1 %，变形杆菌占11. 3 %，葡萄球菌肠毒素占 9.4%，蜡样芽孢杆菌占8.6%，沙门氏菌占8. 1%，致病性大肠杆菌占4%。我国食物中毒的高危食品为肉类、粮食、水产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。这一排序是基于国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况。其中水产品排名第三，是重要的食物中毒高危食品。水产品致病菌导致的食源性疾病影响的国家范围广、危急健康人群多，而且还给国家之间相关的食品贸易带来危机，这使得水产品安全问题受到了空前的关注。这些事实也可以充分说明尽管现代科技已经发展到了相当高的水平，但水产品致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家，都没有很好的被控制，仍然危害着人民的健康。水产品中的致病菌主要有以下两类一是其自身原有致病菌，这类细菌广泛分布于水中，如冷源性细菌单核细胞增生李斯特氏菌，噬热性细菌如副溶血弧菌和霍乱弧菌等； 二是非自身原有致病菌，即生产过程中被污染的致病菌，主要存在与人和动物肠道内及被人或动物粪便污染的水环境中，常见的包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等(杨文鸽，孙翠玲，潘云娣，等，水产品中致病微生物的快速检测方法，中国食品学报，2006，6(1) 402 406)。统计了卫生部公布的国内近十年公布的微生物性食物中毒病例，综合国家食源性疾病监测网部分资料的分析的动态情况，天津出入境检验检疫局提供的调查统计数据，确定水产品致病菌检测芯片检测范围为下列常见的12类菌奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、 创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌(包含福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鲍氏志贺菌和痢疾志贺氏菌共4个种)、小肠结肠炎耶尔森氏菌。我国目前对于水产品的病原菌检测、鉴定手段仍停留常规的微生物学检验水平， 通常以分离培养、生化试验及血清学试验为主，具有操作复杂、手工劳动量大、检验周期长 (6-7天)、特异性不强等缺点，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源水产品的快速检测鉴定能力，并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果的准确性，不能达到新鲜水产品贮藏时间短、需要快速检测的要求。一些简单的分子生物学的方法如PCR、ELISA都有较高的假阳性结果出现，并且运用PCR和ELISA得出的结果都不能作为最终的检测依据。日前丹麦、澳人利亚等一些欧洲和澳洲国家食源性病原菌的检测结果综合了实时荧光PCR和ELISA两种技术在DNA和蛋白质两种水平上检测的结果进行判断，并且实验操作只有Ih左右。因此我国有必要建立起水产品致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定水产品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于水产品中的致病菌所造成的危害，提高我国食源性疾病的检测和控制能力，为加入WTO后尽早与其他国家达成通关协议搭建雄厚的技术平台。1997 年 7 月，Affymetrix，Inc. (Santa Clara, CA)公司的 Thomas R.等人发明的第6，228，575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒，以弥补传统常见水产品致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明提供的用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种1)从奇异变形杆菌16S-23S rDNA间区、普通变形杆菌16S-23S rDNA间区以及从沙门氏菌invA、副溶血弧菌toxR、霍乱弧菌rfbE、单增李斯特氏菌hlyA、金黄色葡萄球菌 nuc、化脓性链球菌speB、创伤弧菌rpoS、蜡样芽孢杆菌群groEL、志贺氏菌ipaH、小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因中选取的DNA序列；2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。本发明的优选实施例中，所述寡聚核苷酸探针具有如SEQ ID NO :2-45所示的核苷酸序列中的至少一种。本发明所述的基因芯片，还包含固定在该固相载体上的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。所述阳性对照探针选自细菌16S rDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或 RNA序列。本发明的优选实施例中，所述阳性对照探针具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本发明所述的基因芯片可以用于检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌。在上述检测应用中，还包含使用检测引物，所述检测引物具有SEQ IDNO :46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。本发明还提供一种用于检测水产品中重要致病菌的试剂盒，其包含上述的基因芯片。本发明所述的试剂盒，还可以包括检测引物，所述检测引物具有SEQID NO :46-67 所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。本发明所述的试剂盒可以用于检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、 蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌。由上述的技术方案可见，本发明将基因芯片技术引入水产品中重要致病菌检测领域同时检测12类致病菌，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒，利用本发明的基因芯片可以达到检测水产品中重要致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，可用于医学检验、食品安全检验、 进出口检验检疫和流行病学调查。为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明显易懂，下面特举较佳实施例， 并配合说明书附图，作详细说明如下。
图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图；图3A为利用本发明的基因芯片检测化脓性链球时的杂交结果；图;3B为利用本发明的基因芯片检测志贺氏菌时的杂交结果；图3C为利用本发明的基因芯片检测金黄色葡萄球菌时的杂交结果；图3D为利用本发明的基因芯片检测沙门氏菌时的杂交结果；图3E为利用本发明的基因芯片检测单增李斯特氏菌时的杂交结果；图3F为利用本发明的基因芯片检测副溶血弧菌时的杂交结果；图3G为利用本发明的基因芯片检测霍乱弧菌时的杂交结果；图;3H为利用本发明的基因芯片检测奇异变形杆菌时的杂交结果；图31为利用本发明的基因芯片检测普通变形杆菌时的杂交结果；图3J为利用本发明的基因芯片检测创伤弧菌时的杂交结果；图3K为利用本发明的基因芯片检测蜡样芽孢杆菌时的杂交结果；图3L为利用本发明的基因芯片检测小肠结肠炎耶尔森氏菌时的杂交结果。
具体实施例方式实施例1探针的设计和制备1.序列获得
5
(1)细菌16S rDNA序列的获得从GenBank公共数据库下载得到十二种菌(奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)的全部16S rDNA序列。(2) 16S-23S rDNA间区序列的获得从GenBank公共数据库下载得到奇异变形杆菌和普通变形杆菌及它们的近缘菌的所有16S-23S rDNA间区序列。(3) ipaH基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌四个种的全部ipaH基因序列。(4) invA基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌的全部irwA
基因序列。(5)toxR基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到副溶血弧菌的全部 toxR基因序列。(6)rfbE基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到霍乱弧菌的全部rfbE 基因序列。(7)hlyA基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到单增李斯特氏菌的全部hlyA基因序列。(8)nUC基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到金黄色葡萄球菌的全部 nuc基因序列。(9) speB基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到化脓性链球菌的全部 speB基因序列。(lO)rpoS基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到创伤弧菌的全部rpoS 基因序列。(1 l)groEL基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到蜡样芽孢杆菌群的全部groEL基因序列。(12)ail基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到小肠结肠炎耶尔森氏菌的全部ail基因序列。2.探针设计(1)细菌的通用探针12类菌全部的16S rDNA序列及其他菌的16SrDNA序列导入 Glustal X软件中，选取靠近间区的一段16S rDNA保守序列作为探针，满足长度35士2bp， Tm75°C 士 2°C。(2)间区探针分别将奇异变形杆菌、普通变形杆菌的所有16S_23SrDNA间区序列导入Glustal X软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作Blast比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。 对照Glustal X比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度35士2bp， Tm75°C 士 2°C。(3)特异基因探针将上述从GenBank公共数据库下载得到的除奇异变形杆菌和普通变形杆菌之外的其它十种菌的特异基因序列，用序列比对软件Glustal X比对，找到各个基因的保守区段，将该保守区段导入01igoArray2. 0软件中，参数设定如下-n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；_t 79 ；-T 90 ；_s 65°C;_x 65°C;-N 2 ；-ρ 33，-P 65 ；_m GGGGG CCCCCTTTTTAAAAA ；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在35bp士2bp，Tm值 75 0C 士 2 °C的探针。3.探针合成将下表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中已包含了延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。4.探针筛选将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。在本发明的优选实施例中，选择了 48条长度在35bp士2bp、Tm75°C 士2°C的探针，并通过360次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为 NO. 1 (SEQ ID N0:1)的探针序列选自所有细菌的16S rDNA，作为阳性对照用来检测是否有细菌，编号为NO. 2的探针作为荧光探针，编号为NO. 3的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO. 3的探针为50% DMS0，用作空白对照，编号NO. 43-N0. 48的6条探针序列 (SEQ ID NO :40-SEQ ID NO :45)选自奇异变形杆菌和普通变形杆菌的16S-23S rDNA间区， 编号NO. 5-N0. 8 (SEQ ID NO :2_SEQID NO :5)的4条探针序列分别选自沙门氏菌invA基因，NO. 9-N0. 13(SEQID NO :6_SEQ ID NO :10)化脓性链球菌 speB 基因，Ν0· 14-NO. 16 (SEQ IDNO 11-SEQ ID NO :13)金黄色葡萄球菌 nuc 基因，NO. 17-N0. 19 (SEQ IDN0:14_SEQ ID NO :16)小肠结肠炎耶尔森氏菌 ail 基因，NO. 20-N0. 27 (SEQ ID NO :17_SEQ ID NO :24) 霍乱弧菌 rfbE 基因，NO. 28-N0. 31(SEQID NO :25_SEQ ID NO :28)创伤弧菌 rpoS 基因， NO. 32-N0. 34 (SEQ IDNO :29-SEQ ID NO :31)单增李斯特氏菌 hlyA 基因，NO. 35-N0. 36 (SEQ IDNO :32-SEQ ID NO :33)副溶血弧菌 toxR 基因，NO. 37-N0. 38 (SEQ IDNO :34_SEQ ID NO: ；35)赌样芽孢杆菌群 groEL基因，NO. 39-N0. 42(SEQID NO :36_SEQ ID NO :39)志贺氏菌 ipaH 基因。表1 本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
权利要求
1.一种用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种1)从奇异变形杆菌16S-23SrDNA间区、普通变形杆菌16S-23S rDNA间区以及从沙门氏菌invA、副溶血弧菌toxR、霍乱弧菌rfbE、单增李斯特氏菌hlyA、金黄色葡萄球菌nuc、化脓性链球菌speB、创伤弧菌rpoS、蜡样芽孢杆菌群groEL、志贺氏菌ipaH、小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因中选取的DNA序列；2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述寡聚核苷酸探针具有如SEQID NO 2-45所示的核苷酸序列中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，还包含固定在该固相载体上的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针选自细菌16S rDNA保守区中的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针具有如SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述的基因芯片在检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包含使用检测引物，所述检测引物具有 SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。
8.一种用于检测水产品中重要致病菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的基因芯片。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测引物，所述检测引物具有 SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列中的至少一种或与SEQ ID NO :46-67所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列中的至少一种。
10.权利要求8所述的试剂盒在检测水产品中奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌中至少一种致病菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒。该基因芯片包括固相载体和寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种1)从奇异变形杆菌1、普通变形杆菌、以及从沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、创伤弧菌、蜡样芽孢杆菌群、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因中选取的DNA序列；2)上述1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；3)上述1)或2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。所述试剂盒包含上述的基因芯片。利用本发明的基因芯片及试剂盒检测水产品中重要致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。
文档编号C12Q1/68GK102311993SQ20101022661
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者冯露, 张恋心, 曹勃阳, 李荣荣, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司