专利名称：一种雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶编码基因与其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶编码基因与其应用，尤其涉及一种雪 莲二氢黄酮醇-4-还原酶及其编码基因与应用。
背景技术：
雪莲花又名雪莲，菊科风毛菊属。是民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本 植物。一般分布于海拔4，000米以上的高山流石滩上。早在《西北域记》和《相园小识》中， 就有关于雪莲的记载。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民 间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、 麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等 入药，但其品质有优劣之分。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪 莲(雪荷花)(S. involucrata Kar. et Kir.)和水母雪莲(S. medusa Maxim)。而水母雪莲 (Saussurea medusa Maxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等 地。水母雪莲是藏药中的名贵药材，具有散寒除湿、活血通络、抗癌、抗炎及抗疲劳等功效， 可治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、痈疮肿毒和高山不适应等多种疾病。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、留醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为 黄酮类化合物。黄酮类化合物的药理作用包括抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗 炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗 辐射。如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲 通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。雪莲黄酮尤其是黄酮醇类药理作用 显著，如水母雪莲黄酮成分对中枢神经系统有抑制作用；以黄酮类化合物为有效成分的雪 莲注射液治疗偏头痛效果显著。黄酮类化合物的生物合成是通过苯丙烷类生物合成途径实现的。是由1分子4-香 豆酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生查耳酮(苯基苯乙烯酮) 开始的，查耳酮合酶是将苯丙烷类代谢途径引向黄酮类合成的第一个最关键酶。二氢黄酮 醇-4-还原酶(DFR)是类黄酮合成途径中通向花色素苷和原花色素的第一个关键酶基因。 由NADPH提供氢DFR可以将二氢黄酮醇的4位酮基还原形成羟基生成无色原花色素，无色 原花色素不稳定进一步被花色素苷元合成酶(ANS)和无色原花色素还原酶(LCR)等酶催化 生成花色素苷和原花色素。二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)与黄酮醇合成酶(FLS)竞争二氢 黄酮醇底物。
发明内容
本发明的目的是提供二氢黄酮醇-4-还原酶蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的一种蛋白质，为二氢黄酮醇-4-还原酶，来源于水母雪莲 (Saussureamedusa Maxim)，命名为SmDFR，该酶是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。其中，序列表中序列2由342个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。为了使1)中的SmDFR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列 上述2)中的SmDFR可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述2)中的SmDFR的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第61-1089所示的DNA序 列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/ 或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。SmDFR蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因为如下1)、2)、3)或4)或5)的所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第61-1089位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端的第56位-1129位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分 子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA 分子。所述步骤5)中的基因，与1)或2)或3)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1166个碱基组成，自5'末端第61-1089位为编码区，编码 序列表中序列2的蛋白质。上述严格条件可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在68°C下杂 交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述SmDFR编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也属于本 发明的保护范围。所述重组载体为在载体pYES2的Hind III和EcoR I位点间插入所述编码基因得到的重组载体。所述重组菌为将所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可用现有的植物表达载体构建含有反义SmDFR编码基因的重组表达载体。所 述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表达载体。 携带有本发明的SmDFR编码基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。使用SmDFR编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任 何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动 子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合 使用；此外，使用本发明的SmDFR编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻 译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子 等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起 始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起 始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素 酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学 试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。上述蛋白质SmDFR在体外还原黄酮类化合物中的应用，或上述编码基因SmDFR在 体外还原黄酮类化合物中的应用也是本发明保护的范围；所述黄酮类化合物优选为二氢黄 酮醇和3-去羟基二氢黄酮醇；所述二氢黄酮醇优选为二氢槲皮素，所述3-去羟基二氢黄酮 醇优选为圣草酚。本发明的另一个目的是提供培育黄酮醇和/或黄酮类含量提高的转基因植物的 方法。本发明提供的方法是是将目的植物中的所述蛋白的编码基因的功能丧失，得到转 基因植物；所述转基因植物中黄酮醇醇和/或黄酮类含量高于所述目的植物；将目的植物中的所述蛋白的编码基因的功能丧失的方法是通过向其中转入重组 表达载体实现的；所述重组表达载体是向PCAMBIA1302载体的多克隆位点中插入DNA片段 得到的，所述DNA片段由CaMV 35S启动子、所述蛋白的编码基因的反向片段和Nos终止子 依次连接而成；所述权利要求1所述蛋白的编码基因的反向片段是序列表中序列1的自5’末端 第56-1129位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段。所述CaMV 35S启动子的序列为genbank V00140. 1中第1-364位核苷酸；所述Nos 终止子启动子序列，genbank AJ007623. 1中第1-318位核苷酸。所述目的植物为双子叶植物，所述双子叶植物优选为新疆雪莲；所述黄酮醇为芦丁、杨梅酮、莰菲醇和/或槲皮素，所述黄酮类为芹菜素。本发明的实验证明，通过构建雪莲cDNA文库，并利用此文库通过简并引物筛选到水母雪莲SmDFR的编码基因，经过酵母表达和体外酶促反应所克隆到的基因是有功能的二 氢黄酮醇-4-还原酶的编码基因，利用特异引物通过PCR克隆了 SmDFR的编码基因，并构建 了含有SmDFR的重组表达载体，获得了转反义SmDFR新疆雪莲。转反义SmDFR新疆雪莲黄 酮醇的测定结果表明，转反义SmDFR新疆雪莲与转空载体的新疆雪莲相比，芦丁和杨梅酮 等黄酮醇含量有明显的提高。说明将反义SmDFR导入雪莲中，可以获得黄酮醇含量升高的 雪莲。本发明的黄酮醇合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要 价值。
图1为水母雪莲SmDFR体外催化二氢槲皮素图2为水母雪莲SmDFR体外催化圣草酚图3为新疆雪莲胚性愈伤的转化和转基因植株再生图4为反义转基因雪莲PCR检测图5为新疆雪莲中类黄酮的HPLC图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因(SmDFR)的克隆与体外表达1.雪莲cDNA文库的构建建库所用水母雪莲1-15天愈伤组织红色系，通过如下方法诱导用水 母雪莲(Saussurea medusa Maxim ；Xie H H, Wang Τ, Matsuda H, et al. 2005. Bioactiveconstituents from Chinese natural medicines XV'inhibitory effect on aldosereductase and structures of Saussureosides A and B from Saussurea medusa. ChemPharm Bull,53(11) =1416-1422 ；公众可以从中国科学院植物研究所获得。)的茎与叶 片作外植体，在含有0. 2mg/L苄氨基嘌呤、2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，pH值5. 8的MS培养 基上诱导出愈伤组织，并在含有2mg/L萘乙酸、0. 5mg/L苄氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养 基中，25士 1°C，16h光照/8h黑暗下培养、继代扩繁获得红色系愈伤组织。分别称取培养1-14天的红色系愈伤组织各50mg，共计700mg混合样品于研钵 中，用TRIZOL Reagent (购自GIBCO公司)提取总RNA。取1-3 μ 1总RNA样品，用SMART cDNALibrary Construction Kit (Catlog# :K1051_1) (CL0NTECH)自带的 CDSIII 酶切位点 的PolyT引物合成第一链cDNA。采用LD PCR(long distance PCR)扩增用cDNA第一链以 获得双链cDNA。加入蛋白酶K消化去除cDNA中的Taq酶，再用Sfi I酶切cDNA，然后用 CHR0MASPIN-400 (Catlog# :636076，Clontech)对 cDNA 进行大小分离。收集大小> 500bp 的cDNA，将收集到的cDNA与λ TripIEx2 Vector (Promega)连接，连接好的DNA由包装蛋白 Packagene Lambda DNA Packaging System(购自 Promega 公司)包装后，力口入明胶使终浓 度为0. 01%，DMSO终浓度为7%，可以在-70°C下保存1年滴度不变。将文库分成20个亚 文库，避免反复冻溶，每个亚文库来自于在原始文库扩增时不同培养皿的回收物，其组成可能不同，可保存，这样就完成了雪莲噬菌体文库构建。2.从雪莲cDNA文库筛选雪莲二氢黄酮醇_4_还原酶基因cDNA根据Genbank上已经登陆的近源物种(主要为菊科)的DFR的基因核苷酸序列的 保守区域(共69aa)，用软件DNAMAN4. 0 (美国Lyrmon Biosoft公司)设计合成上下游部分 简并引物DFRgl :5，-GAG AAT GAA GT(A/G)AT(A/C/T)AA(A/G)CC-3，，DFRg2 :5，-AAA ATA CAT CCA TCC(A/G/C/T)GT CAT-3，。每个亚文库取1 μ L为模板，以DFRgl、DFRg2为引物，25 μ L反应体系，先于95°C加 热IOmin裂解噬菌体，加入PCR扩增混合物，进行PCR扩增。IOXPCR Buffer2. 5 μ 1dNTPs0· 5 μ 1Taq (北京鼎国)0. 2 μ 1Primer DFRgl0. 5 μ 1Primer DFRg20. 5 μ 1Model3. 0 μ 1ddH2017. 8μ 1PCR 程序模板(IX λ稀释缓冲液洗脱的噬菌体)95°C预变性 IOmin ；94"C，4min (热启动 PCR)
94 °C,Imin
52°C’Imin I 40 cycles
72 °C,Imin 72 °C,IOmin 选取信号最强的阳性池，作10倍梯度稀释到IO6倍，每个梯度稀释物取1 μ L为模 板，按同样程序进行PCR检测，确定在下一级筛选时本级阳性池的最大稀释倍数Ν(能够检 测到阳性信号的极限稀释倍数)。将选中的初级阳性池按其最大稀释倍数N稀释，取IyL 稀释物感染大肠杆菌并铺制10个9cm LB平板，培养并回收洗脱物。从平板上挑取生长并 分离良好的单噬菌斑，置于缓冲液中，涡旋震荡，稍离心，于4°C冰箱过夜。取3 μ L洗脱物为 模板，PCR程序扩增检测，获得阳性单克隆，阳性克隆记作pTripIEX2-SmDFR。
Primer VEC20．5 u l
Model3．o u l
ddH。017．8 u l
PCR程序
模板(1×入稀释缓沖液洗脱的噬菌体)95℃预变性lOmin；
94℃，4min(热启动PCR)；
94℃．1min＼50℃，lmin」 40 cycles72℃．1min』
72℃，lOmin
PCR产物电泳检测，克隆得到大小大于1000bp的片段，将该PCR产物测序，结果该PCR产物具有序列表中序列l(基因的cDNA)。将该PCR产物的基因命名为SmDFR，将该基因编码的蛋白命名为SmDFR，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。SmDFR的开放阅读框为序列l的第6卜1089位核苷酸。对采用BLAST相似性分析，通过比较得知，SmDFR全长cDNA序列与cDNA翻译后的 氨基酸序列与同属菊科的植物相似度很高，其中斑点矢车菊(Centaurea maculosa)中的 DFR基因和氨基酸序列的相似性最高，达到92%。表明，从水母雪莲中克隆到的SmDFR为二 氢黄酮醇-4-还原酶的编码基因。5. SmDFR的体外表达与酶促反应产物鉴定1) pYES2-SmDFR表达载体的构建提取水母雪莲的RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用引物SmDFR-Yf和 SmDFR-Yr扩增，引物SmDFR-Yf和SmDFR-Yr的两端分别引入Hind III和EcoRI的识别位 点，引物的序列如下SmDFR-Yf 5' -TCC AAG CTT ACAACATGGTACAAGATTCTC-3，SmDFR-Yr :5’ -GCG GAA TTC AGTACAATGAGACATAAATGT-3，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1092bp的DNA片段，用Hind III 和EcoRI酶切该片段，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的片段与经同样双酶切的pYES2载 体(Invitrogen, Cat. no :v82520)连接，得到重组质粒pYES2_SmDFR。得到的重组质粒 pYES2-SmDFR转化大肠杆菌DH-5 α，经过氨苄青霉素抗性筛选挑去单菌落用5ml液体LB培 养基培养过夜提取质粒，用HindIII和EcoRI酶切质粒DNA鉴定，得到1092bp的片段为阳 性pYES2-SmDFR，将阳性pYES2_SmDFR送去测序，测序结果为该阳性质粒含有序列表中序 列1的自5，末端的第56位-1129位核苷酸(含有SmDFR)，证明为阳性pYES2_SmDFR。2)pYES2_SmDFR 转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) INVScl 和蛋白质诱 导表达将上述获得的阳性pYES2_SmDFR采用LiAC法转入酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) INVScl (Invitrogen, Cat. no :C81000)，得至Ij重组菌 INVScl/ pYES2-SmDFR。将从重组菌中提取的质粒为模板，用引物SmDFR-Yf和SmDFR-Yr扩增验证得 到目的片段(1092bp，序列1的自5，末端的第56位-1129位核苷酸)，将该重组菌命名为阳性重组菌 INVScl/pYES2-SmDFR。将该阳性重组菌INVScl/pYES2_SmDFR进行蛋白质半乳糖诱导表达，按照 Invitrogen公司的pYES2产品说明书，玻璃珠破壁后提取酵母总蛋白，获得SmDFR蛋白粗提 液。采用上述的方法将空载体pYES2载体转入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) INVScl中，获得的INVScl/pYES2，同样诱导表达，得到空载体的蛋白粗提液。3)体外酶促反应以二氢槲皮素(Dihydroquercetin，CAS24198-97-8，SIGMA-ALDRICH T4512-25MG) 和圣草酚(3-Deoxydihydroquercetin，CAS552-58-9，上海亚培生物科技有限公司)为底
物，反应液总体积500 μ 1，其中包括IOOmM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ = 7. 5)370 μ 1SmDFR蛋白质粗提液(0. 15μ g μ Γ1，由上述获得。)70 μ 1IOmM NADPH (溶于 IOOmM Tris-HCl，ρΗ = 7. 5)50 μ 110 μ gy r1 底物(溶于甲醇)10 μ 11.将反应液置于1. 5ml离心管中30°C水浴中保温4h。2.反应液用400 μ 1乙酸乙酯萃取两遍，两次上清乙酸乙酯相合并转移到一个新 的离心管中，敞口放置于50°C烘箱中将乙酸乙酯蒸干。3.残留物用50 μ 1正丁醇盐酸(95 :5，ν/ν)酶促产物的重新溶解，95 °C煮沸 5min，用于 HPLC-MS 鉴定。4)体外酶促反应产物的HPLC-MS鉴定用Agilent 1100 HPLC/MSD Trap VL 鉴定产物。色谱柱Z0RBAX Eclipse XDB-C18,4. 6 X 150mm, 5 μ m(Agilent Co, USA)，柱温 30°C，进样量 10 μ 1，流速 Iml mirT1。流 动相溶液A乙腈，溶液B ρΗ 3. 0三氟乙酸(TFA)水。洗脱程序0-20min =A 90% -10%, B 10% -90%o 检测波长 214nm。质谱参数电喷雾(ESI)离子阱，气化温度325°C，载气(N2)流速10. OlmirT1，载气 压力 40psi，八极射频振幅(octopole RF amplitude) 150vpp, skim 1 voltage34V, skim 2 voltage 6V, capillary exit 107V, cap exit offset 73V，MSn 碰撞能量 40%。分析采用 正离子选择模式(m/z M+H+)，全离子扫描，离子选择范围m/z50-1000。结果如图1和图2所示，图1中A为水母雪莲SmDFR体外催化二氢槲皮素后的总离 子图，箭头所指为底物；B.生成的产物矢车菊素苷元(箭头所指)(m/z 287) ；C.矢车菊素 苷元的质谱图谱。图2中A.水母雪莲SmDFR体外催化圣草酚后的总离子图，箭头所指为底 物；B.生成的产物(箭头所指)(m/z 271) ；C.产物的质谱图谱。从图1可以的产物的出峰 顺序和质谱图显示，底物二氢槲皮素在体外被SmDFR还原后又被化学催化生成了矢车菊素 苷元，二氢槲皮素为黄酮醇的一种；从图2的产物的出峰顺序和质谱图显示，底物圣草酚在 体外被SmDFR还原后又被化学催化生成了(J-Leucofisetinidin，圣草酚为3-去羟基二氢 黄酮醇的一种。表明SmDFR可以体外催化二氢黄酮醇底物生成相应的无色花色素，SmDFR具 有二氢黄酮醇-4-还原酶的活性和黄烷酮还原酶(FlavanonM-reductase，FNR)活性(二 氢槲皮素是二氢黄酮醇-4-还原酶最常用的底物，SmDFR能够催化二氢槲皮素就表明它具有二氢黄酮醇-4-还原酶功能，此外SmDFR还可能具有黄烷酮还原酶功能，以3-去羟基二 氢黄酮醇，即黄烷酮为底物，生成另外一类化合物。)。以上述获得的空载体的蛋白粗提液为对照进行检测，结果为没有活性。实施例2应用反义水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因提高新疆雪莲黄酮醇含量1. pCAMBIA1301-反义SmDFR表达载体的构建以实施例获得的水母雪莲的cDNA为模板，引物DFRa 1和DFRa2的两端分别弓丨 Λ BamHI和Sac I的识别位点，引物DFRal和DFRa2的序列如下DFRal :5，-TAC gag ctc ACAACA TGG TAC AAG ATT CTC-3’ ；DFRa2 :5’ -GCG gga tcc AGT ACA ATG AGA CAT AAATGT-3'；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化DNA片段，用Sac I和BamHI酶切该 片段，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的片段与经同样双酶切的PBI121 (Clontech)载体连接， 将SmDFR cDNA反向插入到pBI121载体CaMV 35S启动子和Nos终止子之间，得到重组质粒 PBI121-反义SmDFR。将重组质粒pBI 121-反义SmDFR转化大肠杆菌DH-5 α，卡那霉素筛选 重组子，提取质粒用Sac I和BamHI双酶切鉴定，将阳性重组子送去测序，结果为得到含有 SmDFR cDNA反向片段的阳性重组子。将pBI121-反义SmDFR载体经EcoRI和PstI酶切，将反义SmDFR连同CaMV 35S 启动子和Nos终止子一起切下，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化片段(2100bp)，将 该片段和经 EcoRI 和 PstI 酶切的 pCAMBIA1302 (Cambia Institute, Austrilia)载体连接， 获得重组表达载体PCAMBIA1302-反义SmDFR。所述CaMV 35S启动子的序列为genbank V00140. 1中第1-364位核苷酸；所述Nos 终止子启动子序列，genbank AJ007623. 1中第1-318位核苷酸。将重组质粒转化大肠杆菌DH-5 α，卡那霉素和潮霉素筛选重组子，提取质粒 用EcoRI和PstI酶切鉴定。用液氮冻融法将pCAMBIA1302-反义SmDFR导入农杆菌 ΕΗΑ105 (Invitrogen)，获得重组子，用卡那霉素、潮霉素和利福平筛选重组子，以单菌落为 模板，CaMV 35S 引物(5' -CCCACTATCCTTCG-3‘)和 DFRal 为引物 PCR 鉴定，得到 IlOObp 的片段为阳性单菌落，命名为EHA105/pCAMBIA1302-反义SmDFR。2.新疆雪莲胚性愈伤的诱导If ifi H ^ (Saussurea involucrata Kar. et Kir. ， Yi Τ, Chen H B, Zhao Z Ζ, etal. 2009. Identification and determination of the major constituents in thetraditional uighur medicinal plant Saussurea involucrata by LC-DAD-MS. Chromatographia,69 537-542 ；公众可以从中国科学院植物研究所获得。)种子的无菌处 理新疆雪莲种子于0. 3%的次氯酸钠溶液中除菌20min，无菌水冲洗5_6次，倒出无菌水 除菌后的新疆雪莲种子用镊子和接种针小心剥去种皮，置于MS+5mg/L 2，4-D+O. 5mg/L6_BA 的培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织生长良好后于MS+3mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA的培养 基上继代培养。新疆雪莲幼胚在诱导培养基上培养40天，每20天继代一次，可长出色泽淡 黄的愈伤组织。3.转反义SmDFR新疆雪莲的获得挑取EHA105/pCAMBIA1302-反义SmDFR的单菌落，将其接种到YEB液体培养基中 (含 Kan (卡那霉素，Kanamycin) 100mg/L, Hyg (潮霉素，Hygromycin B) 50mg/L, Rif (利福
10平，Rifampicin) 50mg/L)，28 °C振荡培养过夜。吸取200 μ 1过夜培养的农杆菌(ΕΗΑ105/ PCAMBIA1302-反义 SmDFR)菌液于 20ml YEB 液体培养基中(含 Kanl00mg/L，Hyg50mg/L, Rif50mg/L)，28°C快速振荡培养生长至对数期(0D600 = 0. 6)，约3_4h。室温6000rpm离心 5min收集菌体，用MStl液体培养基洗一次收集的菌体，确保培养基中不含抗生素，然后将菌 体重新悬浮于IOml MStl液体培养基中待用。挑选生长良好的新疆雪莲愈伤组织，用灼烧后的镊子取出，置于准备好的菌液中， 浸染30min，倒出菌液，愈伤移至MS+3mg/L 2，4-D+O. 5mg/L 6-BA培养基上暗培养48小时 (为防止菌量过多，干扰后期除菌，可在培养基表面放一层滤纸)。最后将材料移至MS+3mg/ L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA+Hyg40mg/L+Cef 400mg/L培养基上筛选培养。20天后可看到绿色 愈伤长出，将筛选出的生长良好的绿色愈伤接种于MS+lmg/L 6-BA+O. Img/LNAA+Hyg40mg/L 的培养基上诱导出17株转反义SmDFR新疆雪莲苗。新疆雪莲从胚性愈伤到分化出幼苗的过程见图3所示。采用相同的方法将空载体PCAMBIA1302转入新疆雪莲中，获得转空载体新疆雪莲。4.转基因新疆雪莲的检测将上述获得的转反义SmDFR新疆雪莲苗用CTAB法提取基因组DNA，以基因组DNA 为模板，以CaMV 35S引物和DFRal为引物PCR检测水母雪莲SmDFR cDNA是否已经整合到 新疆雪莲基因组中，检测结果如图4所示，其中C+ 阳性对照，以pCAMBIA1302-反义SmDFR 为模板；C-阴性对照，以野生型新疆雪莲基因组DNA为模板；M :2000PlusDNA Marker ；A3、 A5、A6、A8、All、A12、A13、A16、A22、A23、A24、A26、A27、A30、A24、A36、A39 均为 TO 代转反 义SmDFR新疆雪莲苗，以TO代转反义SmDFR新疆雪莲基因组DNA为模板。从图中可以看出， 获得17株阳性转反义SmDFR新疆雪莲苗，表明SmDFRcDNA已经整合到新疆雪莲基因组中。5.转基因新疆雪莲黄酮醇含量的检测1)取转反义SmDFR新疆雪莲苗继代后获得转反义SndFR新疆雪莲苗系，IOd取样， 每个系四瓶，从每瓶中挑选生长健壮的转反义SmDFR新疆雪莲苗，去除干叶叶黄叶和底部 愈伤，每瓶选取组培苗叶片鲜重IOOmg左右，放入研钵中在液氮中研磨成粉末，按照每IOmg 鲜重叶片加入100 μ 1 80%甲醇(ν/ν)，转入2ml离心管中，充分混勻，室温下提取24h，其间 每隔几小时上下翻动离心管一次。2)将提取液室温下12，OOOrpm离心lOmin，小心将上清液收集到一个新的离心管 中，所得的沉淀重新用原提取液体积一半的80%甲醇(ν/ν)室温下提取24h。3)室温下，12000rpm离心IOmin收集上清，将两次上清液合并，用0.22 μ m滤膜过 滤后用于HPLC检测。HPLC 检测参数色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18，2. 1 X 150mm，5 μ m(Agilent Co，USA)，柱温30°C，进样量5 μ 1，流速0.25ml mirT1。流动相溶液A 0.20%磷酸水溶液，溶 液B 甲醇。洗脱程序:0-3min,95%A,5%B ；3_20min，A 95% -65%,B 5% -35%;20-30min, A 65 % -60 %, B 35 % -40 % ；30_38min :A 60 %, B 40 % ；38_45min :A 60 % -80 %, B 40% -20% ；45-49min :A 80%, B 20% ；49_50min :A 80% -95%, B 20% -5% ；50_70min A 95%，B5%。检测波长 270nm。在如上色谱条件下，类黄酮标准品(芹菜素SIGMA-ALDRICH 460475 ；莰菲醇 SIGMA-ALDRICH K1003 ；槲皮素 SIGMA-ALDRICH Q0125 ；杨梅酮 M6760 ；芦 丁 SIGMA-ALDRICHR5143)的保留时间如图5A所示。检测样品中各种黄酮醇的保留时间分别 是芦丁 27. 6min,杨梅酮29. 2min,槲皮素32. 3min,莰菲醇34. 7min ；另外黄酮类中的芹菜素 (莰菲醇的衍生物)的保留时间为35. lmin。以转空载体新疆雪莲和野生型(新疆雪莲)为对照，实验重复四次，结果取平均 值。结果如图5所示，其中A 类黄酮标准品；B SmDFR-A39 (编号为A39的转反义 SmDFR新疆雪莲苗株系)；C 野生型对照。SmDFR-A39的保留时间如图5B所示，检测样品 中各种黄酮醇的保留时间分别是芦丁 27. 5min,杨梅酮28. 9min,槲皮素32. 8min,莰菲醇 34. 4min;另外黄酮类中的芹菜素(莰菲醇的衍生物)的保留时间为35. 3min。野生型对照 的保留时间如图5C所示，检测样品中各种黄酮醇的保留时间分别是芦丁 27. 6min，杨梅酮 29. lmin，槲皮素 31. 7min。图中显示SmDFR_A39中芦丁、杨梅酮等黄酮醇和/或黄酮类的含量较野生型 对照显著升高，具体计算可知，野生型对照的芦丁为25. 16士6. 68 μ g/g鲜重、杨梅酮为 22. 43士4. 57 μ g/g 鲜重，莰菲醇为 9. 23士0. 49 μ g/g 鲜重、槲皮素为 0. 78士 1. 35 μ g/g 鲜 重、芹菜素为3. 68士 1. 19 μ g/g鲜重，SmDFR-A39的芦丁为71. 15士 17. 64 μ g/g鲜重、杨梅酮 为 54. 30士9. 81 μ g/g 鲜重、莰菲醇为 13. 41 士4. 07 μ g/g 鲜重、槲皮素为 10. 76士2.71 μ g/ g鲜重和芹菜素16. 47士 12. 07 μ g/g鲜重。转空载体新疆雪莲与野生型对照的结果无显著差别。表明导入反义水母雪莲SmDFR基因使新疆雪莲中黄酮醇含量增加。将黄酮代谢途 径中的有效基因导入到新疆雪莲中，然后再生成高产黄酮转基因苗，进行人工栽培，将是解 决雪莲野生资源短缺的有效途径。
权利要求
一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求1或2所述编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)、2)、3)或 4)或5)的所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第61-1089位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端的第56位-1129位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组载体或重组菌，其特征在于所述重组载体为在载体 PYES2的多克隆位点插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组载体；所述重组菌为将权利要求4所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌；所述宿主菌优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6.权利要求1所述蛋白质在体外还原黄酮类化合物中的应用，或权利要求2或3所 述编码基因在体外还原黄酮类化合物中的应用；所述黄酮类化合物优选为二氢黄酮醇和 3-去羟基二氢黄酮醇；所述二氢黄酮醇优选为二氢槲皮素，所述3-去羟基二氢黄酮醇优选 为圣草酚。
7.一种培育黄酮醇和/或黄酮类含量提高的转基因植物方法，是将目的植物中的权利 要求1所述蛋白的编码基因的功能丧失，得到转基因植物；所述转基因植物中黄酮醇和/或 黄酮类含量高于所述目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于将目的植物中的权利要求1所述蛋白的 编码基因的功能丧失的方法是通过向其中转入重组表达载体实现的；所述重组表达载体是 向PCAMBIA1302载体的多克隆位点中插入DNA片段得到的，所述DNA片段由CaMV 35S启动 子、权利要求1所述蛋白的编码基因的反向片段和Nos终止子依次连接而成；所述权利要求1所述蛋白的编码基因的反向片段是序列表中序列1的自5’末端第 56-1129位核苷酸所示DNA片段的反向互补片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物，所述双子叶 植物优选为新疆雪莲；所述黄酮醇为芦丁、杨梅酮、莰菲醇和/或槲皮素；所述黄酮类为芹 菜素。
全文摘要
本发明公开了一种雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶编码基因与其应用。本发明提供的一种蛋白质，为二氢黄酮醇-4-还原酶，命名为SmDFR，该酶是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，通过构建雪莲cDNA文库，并利用此文库通过简并引物筛选到水母雪莲SmDFR的编码基因，经过酵母表达和体外酶促反应所克隆到的基因是有功能的二氢黄酮醇-4-还原酶的编码基因。本发明的黄酮醇合成相关蛋白及其编码基因对解决雪莲野生资源短缺的问题有重要价值。
文档编号C12N15/113GK101921735SQ20101022634
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者乔献丽, 吕晓芬, 赵德修, 陈福东 申请人:中国科学院植物研究所