用于简易检测黑素瘤的方法和试剂的制作方法

专利名称：用于简易检测黑素瘤的方法和试剂的制作方法
用于简易检测黑素瘤的方法和试剂
背景技术：
皮肤恶性黑素瘤是一种严重的健康问题，预计2008年美国将有至少62，000例侵 袭性黑素瘤新病例，其中8，200例将死于该疾病。黑素瘤发病率持续增加，快于任何其他恶 性肿瘤。另外，其为青年成人中最常见的癌症之一，并因而，在平均损失生命年数方面其为 排名第二的一类癌症。已显示某些蛋白质与黑素瘤及其转移相关。已经在免疫组织化学中使用这些蛋 白质或它们的活性，以鉴定转移，这些蛋白质包括LlCAM(Thies等人，(2002) ；Fogel等人， (2003))和S-IOO(Diegc)等人，(2003))。高密度微阵列已应用于同时监测生物样品中成千 上万种基因的表达。研究导致鉴定了在良性和恶性病变中差异表达的基因，以及具有预后 价值的基因。Luo等人，(2001)和Wang等人，(2004)。用含有可监测8，150种mRNA转录物 表达的探针的微阵列进行了恶性黑素瘤的基因表达谱分析。Bittner等人，(2000)。这些 研究者鉴定了若干种可能与恶性肿瘤行为相关的基因。在最近的工作中，比较了黑素瘤细 胞系和正常黑素细胞系的基因表达谱，导致鉴定了在黑素瘤中差异表达的基因和受到调节 的途径。Takeuchi等人，(2004)。另外，前列腺分化因子⑶F15、粘附分子LlCAM和驱动蛋 白样5、骨桥蛋白、组织蛋白酶B、钙粘蛋白3和早老蛋白2被鉴定为有希望的黑素瘤检测标 志物(Talantov 等人，(2005) ；Wang 等人，(2007))。

发明内容
本发明提供通过如下步骤鉴定黑素瘤的方法获得组织样品；分析和测量样品中 编码对应于 SILV(me20m) (SEQ. ID NO :1_3)和酪氨酸(TYR) (SEQ. ID NO 4)的 mRNA 的基因 的表达水平。TYR用作确认黑素细胞在受检样品中存在的归一化对照。本发明还提供通过 如下步骤鉴定黑素瘤的方法获得组织样品；并且分析和测量编码对应于GDF15或LlCAM 中的一者或两者并且分别由引物/探针组SEQ. ID NO :5-7和8-10所识别的mRNA的基因 在样品中的表达水平，其中高于预定截止值的基因表达指示存在黑素瘤。本发明还提供通过如下步骤区分恶性黑素细胞和良性黑素细胞的方法获得组织 样品；并且分析和测量编码SILV的基因在样品中的表达水平，其中高于预定截止值的基因 表达水平指示样品中存在黑素瘤。本发明还提供通过如下步骤区分恶性黑素细胞和良性黑素细胞的方法获得组织 样品；并且分析和测量编码⑶F15和LlCAM中的一者或两者并且由引物/探针组SEQ/ID NO. :5-7和8-10识别的基因在样品中的表达水平。高于预定截止值的基因表达水平指示 样品中存在黑素瘤。本发明还提供通过如下步骤确定患者治疗方案的方法从患者获得组织样品；并 且分析和测量编码SILV的基因在样品中的表达水平，其中高于预定截止水平的基因表达 水平指示样品中存在黑素瘤。本发明还提供通过如下步骤确定患者治疗方案的方法从患者获得组织样品；并 且分析和测量编码⑶F15和LlCAM中的一者或两者并且由引物/探针组SEQ/ID NO. :5_7和
38-10识别的基因在样品中的表达水平，其中高于预定截止水平的基因表达水平指示样品中 存在黑素瘤。最终的标志物是SILV，并且在本文中其被定义为编码任何变体、等位基因等的基 因。SILV也被描述为黑素细胞蛋白17 ；PMEL17 ；前黑素体蛋白；PMEL ；GP100 ；ME20 ；SI ；SIL ； D12S53E，并且由登录号NM_006928. 3表示。本发明还提供用于进行分析以确定细胞样品中 黑素瘤存在的试剂盒，其包含核酸扩增和检测试剂。本发明还提供了用于扩增和检测本发明方法所获得的PCR产物的引物/探针组。 这些组包括如下序列SEQ.IDNO1，SILV，正向引物，AGCTTATCATGCCTGGTCAA
SEQ.IDNO2，SILV，反向引物，GGGTACGGAGAAGTCTTGCT
SEQ.IDNO:3，SILV，探针，FAM-AGGTTCCGCTATCGTGGGCAT-BHQ1
SEQ.IDNO4, ABI AoD*, Hs00165976_ml
SEQ.IDNO5，⑶F15，正向引物，CGCCAGAAGTGCGGCT
SEQ.IDNO6，⑶F15，反向引物，CGGCCCGAGAGATACGC
SEQ.IDNO:7，⑶F15，MGB 探针，FAM-ATCCGGCGGCCAC
SEQ.IDNO:8，L1CAM，正向引物，ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTC
SEQ.IDNO:9，L1CAM，反向引物，AGATATGGAACCTGAAGTTGCACTG
SEQ.IDNO:10，L1CAM, MGB 探针，FAM-CACCATCTCAGCCACAGC 本发明还提供通过本发明方法所利用的PCR方法获得的扩增子。这些扩增子包括 以下序列SEQ. ID NO :11，GDF15 PCR 扩增子CGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGSEQ. ID NO 12 LlCAM PCR 扩增子ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTCAGATTTTGGCAACATCTCAGCCACAGCGGGTGAAAACTACAGTGTC GTCTCCTGGGTCCCCAAGGASEQ. ID NO 13 SILV PCR 扩增子AGCTTATCATGCCTGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAGGTTCCGCTGATCGTGGGCATCTTGCTGGTGT TGATGGCTGTGGTCCTTGCATTATGAAGCAAGACTTCTCCGTACCCCTCTGATATATAGGCGCAGACTSEQ. ID NO 14 TYR PCR 扩增子TCTGCTGGTATTTTTCTGTAMGACCATTTGCAAMTTGTMCCTMTACAMGTGTAGCCTTCTTCCM


图1是示出了 SILV、⑶F15和LlCAM在区分良性和恶性皮肤病变中的性能的坐标图。图2是描绘了 SILV、⑶F15和LlCAM在区分明确的黑素瘤和良性痣中的灵敏度对 特异性的坐标图。图3是SILV在区分黑素瘤和非典型痣中的性能的坐标图。图4是描绘了 SILV在区分明确的黑素瘤和良性痣中的灵敏度对特异性的坐标图。
具体实施例方式本发明提供了定性和定量鉴定黑素瘤；区分恶性黑素细胞和良性黑素细胞；诊断 具有不明确的病理学特征的黑素细胞病变；以及确定黑素瘤患者治疗方案的方法。这些方 法还提供了对患者预后、患者监测和药物开发的辅助。这些方法依赖于分析和测量作为黑 素瘤活检分析的最终标志物的SILV (me20m)的表达水平，其中相对于TYR归一化对照，某一 水平的基因表达可指示分析样品中恶性黑素细胞的存在。本发明集中于所鉴定的基因表达标志物用于在多种皮肤病变中诊断恶性黑素瘤 的用途，包括使用石蜡包埋(“FFPE”)组织，称为不明病例的具有不明确的形态学特征或疑 似原发性黑素细胞病变。在这种背景下皮肤病理学家的观点会出现分歧。因而，本发明的 用途是在基因表达测定法(基于RT-PCR)中鉴定可区分良性黑素细胞皮肤病变和原发性黑 素瘤的基因表达标志物，用于诊断可疑病变中的黑素瘤。使用RT-PCR，对分离自47例原发性黑素瘤、48例良性皮肤痣和98例非典型/可 疑的痣(包括48例非典型痣和50例黑素瘤(由皮肤病理学家指定))组织样本的总RNA 进行了分析。通过对黑素瘤、良性痣和非典型/可疑的皮肤样品进行一步定量RT-PCR测定 法，检测了三种黑素瘤特异性基因(SILV、⑶F15和L1CAM)的差异基因表达。结果证明了将 SILV用作最终标志物可区分含有良性或恶性黑素细胞的临床相关组织样品的能力。高密度cDNA和低聚核苷酸微阵列使得能同时监测成千上万种基因的表达。微阵 列技术提供了对mRNA丰度的定量测量并且作为基于基因表达发现标志物的工具已获得接 受。在癌症研究方面，微阵列分析已鉴定了在良性和恶性病变、不同癌症类型中差异表达的 基因或具有预后意义的基因。Luo等人，(2001) ；Su等人，(2001) ；Henshall等人，(2003)； 和Wang等人，(2004)。第一次恶性黑素瘤的基因表达谱分析使用了含有8，150种mDNA转 录物的探针的微阵列，并且鉴定了可能与恶性肿瘤行为相关的基因。Bittner等人，(2000)。 由于他们的研究中所分析的样品不包括含有正常或良性黑素细胞的组织，因此没有鉴定在 恶性黑素瘤中差异表达的基因。与正常皮肤相反，良性痣中的黑素细胞含量与黑素瘤中的 接近。在另一研究中，将源自黑素瘤或良性痣组织的两种合并的样品与cDNA阵列杂交， 发现了在源自黑素瘤或源自痣的样品中优先表达的基因。Seykora等人，(2003)。其他研究 者使用了扣除杂交或对黑素瘤细胞系上产生的SAGE文库的分析，用于监测黑素瘤中的基 因表达。Hipfel等人，(2000)；和Weeraratna (2004)。最近，将一些黑素瘤细胞系和黑素细 胞系的基因表达谱进行比较导致鉴定了一些差异表达的基因和在黑素瘤中受调节的途径。 Hoek等人，(2004)。虽然这些研究为黑素瘤遗传学提供了坚实的基础，但还没有明确区分 黑素瘤和良性组织的标志物。目前所用的几种标志物(例如酪氨酸酶、HMB-45、mart-a/黑 素-a和MITF)还没有被证实具有黑素细胞肿瘤鉴定的预后价值(Phsie等人，(2008))。因 此，这些标志物具有有限的临床用途。如美国专利公布No.20070154889(将其以引用的方式全文并入本文)中所公开 的，PCR被证明对检测黑素瘤的转移具有足够的特异性和灵敏度。在本发明中，提供了一种 在从初级皮肤活检材料区分黑素瘤和非黑素瘤病变中具有改善的诊断性能的方法。本发明 的分析法可用于对可疑的(或不明确的)病变进行明确地(或不含糊地)诊断。因而，本 发明可特别用于检测早期组织样品。优选的是，概率度量将相对于良性黑素细胞或正常组织来区分具有黑素瘤的组织。本发明方法采用从FFPE组织样品提取核酸的快速技术和扩增和检测指示原发性 皮肤病变的核酸片段的方法。这些核酸片段定性和定量地测量由标志基因编码的mRNA。组 织样品包括源于打孔活织检查、针吸活组织检查、切除活组织检查、刮取活组织检查的皮肤 病变。本文所提供的方法使得能在初级皮肤活检组织样品中进行黑素瘤检测，使得医师能 确定是否要立即对早期疾病实施适当的治疗方案。在本发明的方法中，对用于进行测定法 的组织充分采样很重要。这包括对组织样品进行正确切除和处理以及提取RNA。一旦获得 样品，正确处理组织样品以便检测任何存在的癌性细胞很重要。在本发明的一种方法中，RNA分离自FFPE组织样品块。可以使用任何合适的市售 石蜡试剂盒，例如来自Roche的High Pure RNA Paraffin Kit (高纯度RNA石蜡试剂盒) (产品目录号3270289)。优选的是，如下根据包埋肿瘤的大小对FFPE样品进行切片2 至5mm切成9 X 10 μ m ；彡6至8mm切成6 X 10 μ m。根据生产商提供的说明书对切片去除石 蜡，并可将分离的RNA存储于-80°C的无RNA酶的水中。就测量mRNA水平来确定基因表达而言，可通过本领域已知的任何手段来进行分 析，并且包括诸如PCR、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸 序列的扩增(NASBA)等之类的方法。所涉及的快速分子诊断学最优选的是定量PCR方法， 包括QRT-PCR。可通过本领域已知的任何方法进行检测，包括微阵列、基因芯片和荧光。典型的PCR包括多个扩增步骤或循环，其选择性扩增靶核酸种类。典型的PCR包 括三个步骤变性步骤，其中靶核酸变性；退火步骤，其中一组PCR引物(正向引物和反向 引物)退火至互补DNA链；延伸步骤，其中热稳定性DNA聚合物延伸引物。通过重复该步骤 多次，DNA片段被扩增而产生对应于靶DNA序列的扩增子。典型的PCR包括20个或更多个 变性、退火和延伸循环。通常，退火后延伸步骤可同时进行，在这种情况中该循环仅含两个 步骤。在本发明的一个实施例中，RT-PCR扩增反应可在使得这些步骤中每一个步骤的时 长可在数秒的范围内，而不是在数分钟的范围的时间上进行。具体地讲，使用能产生至少每 秒5°C的热升温速率的热循环仪，可在30分钟或更短时间内使用RT-PCR扩增。更优选地， 扩增在少于25分钟内进行。据此，对PCR循环的每个步骤提供的以下时间不包括升温时 间。变性步骤可进行10秒钟或更少的时间。事实上，某些热循环仪具有“0”秒的设置，这 可能是最佳的变性步骤持续时间。即，其足够热循环仪达到变性温度。退火和延伸步骤最 优选每一者均少于10秒，并且当在相同的温度下进行时，组合的退火/延伸步骤可以少于 10秒。一些同质探针检测方法可能需要单独的延伸步骤，以使快速测定性能最佳。为了使 总扩增时间和非特异性副反应两者最小化，退火温度通常高于50°C。更优选地，退火温度高 于 55 0C ο对RT-PCR来说单个合并反应(无实验者的干预)因为如下若干原因是理想的 (1)实验误差风险降低；(2)靶标或产物污染风险降低；以及(3)测定速度加快。反应可由 一种或多种聚合物酶组成。就两种聚合酶而言，这些酶的其中之一通常是基于RNA的DNA 聚合酶(逆转录酶)，而另一种酶是热稳定的基于DNA的DNA聚合酶。为了使测定性能最 佳，优选对这两种酶促功能均采用“热启动”技术的形式。美国专利5，411，876和5，985，619 提供了不同的“热启动”方法的例子，将这两篇专利以引用的方式并入本文。优选的方法包括使用一种或多种热启动方法，这些方法可掩蔽有效进行DNA聚合所需的一种或多种组 分。美国专利5，550，044和5，413，924描述了制备用于这类方法的试剂的方法，将这两篇专 利以引用的方式并入本文。美国专利6，403，341描述了一种隐蔽方法，该方法涉及其中一 种PCR试剂组分的化学改变，将该专利以引用的方式并入本文。在最优选的实施例中，RNA 依赖性和DNA依赖性聚合酶两者的活性存在于单一酶中。有效进行扩增所需的其他组分包 括三磷酸核苷、二价盐和缓冲液组分。在某些情况下，非特异性核酸和酶稳定剂可能是有利 的。在优选的RT-PCR中，某些逆转录酶和PCR组分的量是非典型的，以便利用某些热 循环仪的较快升温时间。具体地讲，引物浓度非常高。用于逆转录酶的典型的基因特异性引物浓度为少于约20nM。为了实现快速逆转 录酶反应以一至两分钟的数量级进行，逆转录酶引物浓度升高至大于20nM，优选至少约 50nM，并且通常为约ΙΟΟηΜ。标准的PCR引物浓度范围是IOOnM至300nM。在标准的PCR中 可使用较高的浓度以补偿Tm变化。然而，为了本发明目的，参考的引物浓度是用于其中不 需要补偿Tm的情况。如果Tm补偿是必须的或理想的，则可以经验方法确定和使用成比例 增高的浓度的引物。为了实现快速PCR，PCR引物浓度通常高于250nM，优选高于约300nM， 并且通常为约500nM。商业使用的诊断方法也优选采用一种或多种内部阳性对照，其可在阴性结果的情 况下确认特定扩增反应的进行。在RT-PCR中必须控制的假阴性结果的可能原因包括RNA 量不足、RNA降解、RT和/或PCR的抑制以及实验误差。就测量蛋白质含量来确定基因表达而言，本领域任何已知的方法都是合适的，只 要其可导致足够的特异性和灵敏度。例如，可通过使蛋白质结合至该蛋白质特异性的抗体 或抗体片段，并测量抗体结合的蛋白质的量来测量蛋白质含量。可用放射性荧光试剂或其 他可检测试剂标记抗体，以方便检测。检测方法包括(但不限于)酶联免疫吸附测定法 (ELISA)和免疫印迹技术。本发明提供了足以鉴定组织样品中的恶性黑素细胞的特异性和灵敏度。这些方法 通过测量由标志物编码的mRNA来确定特定标志物基因SILV的表达。本文示出的结果表 明，SILV是证实可明确辨别黑素瘤病例和良性的明确病例以及辨别可疑组织样品组中的不 同非典型亚组的首要标志物。在本文中标志物定义为编码任何变体、等位基因等的基因，包 括 SEQ IDNO 1-3。在本发明方法中，将酪氨酸酶用作对照基因，以证明组织样品中存在黑素细胞 以及对黑素细胞含量进行归一化。Mandelcorn-Monson等人，(2003)；以及美国专利 No. 6，153，388对酪氨酸酶进行了描述，并且由登录号No. NM_000372表示。酪氨酸酶也定 义为编码由ABI assay ondemand识别的mRNA的基因(Hs00165976_ml)，PCR扩增子为SEQ ID NO :14。任何给定的基于扩增的分子诊断法的特异性很大程度上(但不是排他地)依赖于 引物组的种类。引物组是成对的正向和反向寡核苷酸引物，其退火至靶DNA序列以使得能 扩增靶序列，从而产生靶序列特异性的扩增子。引物必须能扩增所关注的疾病状态的标志 物。就本发明而言，标志物涉及黑素瘤。反应必须还含有检测特异性信号的某些手段。这优选通过使用试剂来完成，这些试剂可检测源于所关注靶序列的聚合反应的DNA序列的区域。当结合至所关注的特异性核 酸序列时，用于检测的优选试剂产生可测量的信号差异。通常，这些方法涉及在结合至所关 注序列时引起荧光增加的核酸探针。通常，通过针对每种PCR引物对分析扩增子产生的相 对速率来监测本发明方法的反应进展。本发明还包括引物/探针组及其在受权利要求书保护的方法中的用途。这些序 列的ID是SEQ，ID No. 1-100可通过多种检测试剂和方法来监测扩增子产生，包括但 不限于荧光引物，以及结合双链DNA的荧光探针和荧光染料。也可使用分子信标、蝎型物 (Scorpion)和其他检测方案。监测PCR的通用方法采用荧光水解探针测定法。该方法利用 某些热稳定性DNA聚合酶(例如Taq或Tfl DNA聚合酶)的5 ‘核酸酶活性，在PCR过程 中裂解寡聚探针。本发明还提供通过本发明方法中利用的PCR方法提供的扩增子。这些扩增子包括 如下序列:SEQ. ID No 11-14。选择寡聚物，在延伸条件下退火至扩增的靶序列。探针通常在5'末端具有荧光 报告分子，在3’末端具有荧光猝灭剂。只要寡聚物是完整的，来自报告分钟的荧光信号就 被猝灭。然而，当寡聚物在延伸过程中被消化时，荧光报告分子不再临近于猝灭剂。可将 给定扩增子的游离荧光报告分子的相对积聚与对照样品的相同扩增子的积聚和/或对照 基因例如(但不限于)β -肌动蛋白或PBGD的积聚相比较，以确定RNA群体中给定RNA的 给定cDNA产物的相对丰度。荧光水解探针测定法的产物和试剂容易商购获得，例如，购自 Applied Biosystems0最优选的检测试剂是TaqMaη .探针(Roche Diagnostics，Branchburg，NJ)，它 们在美国专利5，210，015 ；5, 487，972和5，804，375中有所描述，将这些专利以引用的方式 并入本文。基本上，这些探针涉及通过分离探针上的荧光_猝灭剂组合而进行核酸检测，所 述分离是通过用于PCR中的5’ -3’外切核酸酶活性。任何合适的荧光团都可以用于任何 标志物或对照。这些荧光团包括(但不限于)Texas RecUCal Red、Fam、Cy3和Cy5。在一 个实施例中，以下荧光团对应于指出的标志物=PLAB =Fam ；LlCAM =Texas Red或Cal Red ； 酪氨酸酶C1 ；PBGD :Cy5。可容易获得用于控制和监测扩增子积聚的设备和软件，包括购自 Cepheid ofSunnyvale, California 的 Smart 热循环仪禾口购自 Applied Biosystems 的 ABI Prism 7900的序列检测系统。在上述QRT-PCR的方法的商业化中，某些用于检测特定核酸的试剂盒尤其有用。 在一个实施例中，试剂盒包括扩增和检测标志物的试剂。任选地，试剂盒包括样品制备试剂 和/或制品(如试管)，以从淋巴结组织提取核酸。该试剂盒也可以包括使样品污染的风险 最小的制品(如用于淋巴结切开和制备的一次解剖刀和表面)。在优选的试剂盒中，包括了上述单管QRT-PCR方法的必要试剂，例如逆转录酶、逆 转录酶引物、相应的PCR引物组(优选针对标志物和对照)、热稳定性DNA聚合酶(例如 Taq聚合酶)和合适的检测试剂，例如(但不限于)蝎型探针、用于荧光水解探针测定法的 探针、分子信标探针、双链DNA的特异性单染料引物或荧光染料(例如溴化乙锭)。弓丨物优 选为产生上述高浓度的量。热稳定性DNA聚合酶通常可在商业上从多个制造商获得。试剂 盒中的额外材料可以包括合适的反应试管或管形瓶、屏蔽组分，通常是蜡珠，任选包括镁； 逆转录酶和PCR阶段的反应混合物(通常为10X)，包括必要的缓冲液和试剂，例如dNTP ；不含核酸酶或不含RNA酶的水；RNA酶抑制剂；可用于QRT-PCR的逆转录酶和/或PCR阶段的 对照核酸和/或任何额外的缓冲液、化合物、辅因子、离子组分、蛋白质和酶、聚合物等。可 任选地，试剂盒包括核酸提取试剂和材料。说明书也优选包括在试剂盒内。提供了如下实例来举例说明受权利要求书保护的本发明但不对其进行限制。实例1患者的临床和病理学特征从在乔治城大学医院(Georgetown University Hospital)诊断患有原发性黑素 细胞皮肤病变的患者选择了 204份FFPE皮肤活检组织样本。该患者系列包括102份具有明 确的侵袭性黑素瘤或良性痣特征的样本和102份具有各种程度的细胞异型度的样本。这些 非典型样本最初被分类为可疑的/非典型的样本，随后由皮肤病理学专家辨别为非典型痣 或恶性黑素瘤。排除了两份患者样品，因为在样品制备步骤后RNA收率不足(少于350ng)。 由于PCR控制失败，又排除了另外九份RNA样品。符合条件用于分析的最终样品组由193 份活检组织(起始样品组的95% )，代表47份黑素瘤、48份良性痣和98份非典型/可疑活 检组织(通过皮肤病理学家进行归属，包括48份非典型痣和50份黑素瘤)。这些黑素瘤样 品的病理学和临床特征的汇总在表1中示出。表 1
患者特征晚期黑 素瘤黑素瘤严重非 典型中度非 典型良性 痣平均年龄59514244042性别女性83520833男性64815515T期(厚度)Tis21Tl ( < Imm)162T2(l. 01-2mm)7Τ3(2· 01-4mm)3T4 ( > 4mm)1M2诊断浅表扩展性黑素瘤650结节性黑素瘤5原位黑素瘤21恶性雀斑11黑素瘤，其他31复合痣31炎性复合痣13
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权利要求
一种鉴定黑素瘤的方法，所述方法包括如下步骤a.获得组织样品；和b.测量所述样品中编码对应于SILV的mRNA的基因(SEQ ID No.1 3和13)的表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括测量编码酪氨酸酶的基因(SEQID NO :4和14)的表达水平。
3.根据权利要求1和3所述的方法，所述方法测量SILV相对于TYR的表达水平。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述样品是初级皮肤活检样品。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中基因表达在微阵列或基因芯片上测量。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中基因表达通过核酸扩增来确定，所述核酸扩 增通过从所述样品提取的RNA的聚合酶链反应(PCR)来进行。
7.一种方法，其中黑素瘤诊断的概率从权利要求1、2或3确定。
全文摘要
本发明公开了用于简易检测黑素瘤的方法和试剂，通过确定指示黑素瘤的特定基因的差异表达是否超过截止值而提供在活检组织中鉴定早期恶性黑素细胞的测定法。
文档编号C12N15/11GK101948915SQ201010226228
公开日2011年1月19日 申请日期2010年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者D·塔兰托夫, H·王, J·F·帕尔马, T·杰特克, T·维纳, Y·王 申请人:维里德克斯有限责任公司