专利名称：一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法
技术领域：
本发明涉及一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法，属于动物基因工程和生物化学领域。
背景技术：
核糖核酸(ribonucleic acid,简写为RNA)是生物细胞中的遗传信息载体,普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，也是基因工程中研究基因表达以及克隆目的基因等过程需要操作的重要生物大分子。由于RNA极不稳定，容易发生特异性或非特异性降解，所以在实验过程中通常选用新鲜的样本并且立刻提取纯化RNA，这极大地増加了实验的复杂程度并降低了样品收集和处理的效率。因此，研究人员也开发了不同的方法直接保存新鲜样本，以便以后提取完整的RNA。针对动物的肌肉组织而言，直接保存样本以便之后提取RNA的方法主要有两类。第一种方法是样品采集后直接放入液氮保存。这种方法对于这对样本的采集时间和保存具有很大的限制性，尤其体现在对于特殊设备的需求上，例如液氮罐。如果不能将新鲜采集的肌肉样本立刻至于液氮中，除了 RNA分子可能发生降解之外，由于应激反应产生新的RNA都可引起RNA状态的改变，给后续的实验带来操作误差。第二类方法是将采集的组织样品置于市售的RNA保存液中，室温短期保存或者低温长期保存。但是，商品化的组织RNA保存液价格较为昂贵，且使用量较大，一般是样本体积的5-10倍，极不经济。目前使用的可以手工配制的组织RNA保存液的配方均为含有多种盐类水相体系，例如柠檬酸钠，硫酸铵，异硫氰酸胍，こニ胺四こ酸等。其不但配制复杂，成本较高，而且水相体系还存在样品浸润时间较长的问题，一般需要在4摄氏度下放置24小时，使用不方便。因此，研究和开发用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法。利用本发明所述的有机相试剂能够实现快速浸润和处理肌肉组织样品，达到高效而经济的保存其中RNA组分的目的。为实现上述目的，本发明提供了一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液，所述保存液由こ醇、甲醇和三氯こ酸配比而成，其特征在于所述こ醇含量以体积百分比计占保存液总体积的95、9%，所述甲醇含量以体积百分比计占保存液总体积的1飞％，所述三氯こ酸含量以质量百分比计占保存液总质量的0. f 1%。上述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液中所述保存液中こ醇含量以体积百分比计优选占保存液总体积的96. 5 98%，所述甲醇含量以体积百分比计优选占保存液总体积的2 3. 5%，所述三氯こ酸含量以质量百分比计优选占保存液总质量的0. 2^0. 35%。
为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液，所述浸润液由甲醇和こ醇配比而成，其特征在于所述甲醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的90、9%，所述こ醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的f 10%。上述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液中所述浸润液中甲醇含量以体积百分比计优选占浸润液总体积的95、8%，所述こ醇含量以体积百分比计优选占浸润液总体积的2 5%。为实现上述目的，本发明提供了ー种保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，步骤是将新鲜采集的动物肌肉样品切成粒径不大于IOmm的块状，用其等体积量的上述的浸润液冲洗1-2次,然后转到体积量为其体积2-5倍的浸润液中，室温放置0. 5-2小时；之后过滤除去浸润液；将除去浸润液的样品置于含有其3-10倍体积量的上述保存液的瓶中，密封瓶ロ，常温下保存动物肌肉组织24-48小时；或4°C保存动物肌肉组织1-2周；或者置于液氮中保存动物肌肉组织1-1. 5年。其中，上述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法中所述样品优选切成粒径为
4-5mm的块状。所述用于浸润样品的浸润液使用体积量优先选择样品体积的3_4倍，室温放置时间优选为1-1. 2小吋。所述用于保存样品的保存液使用体积量优先选择样品体积的
5-8倍。基于上述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，在对保存的动物肌肉组织进行RNA提取之前，可直接过滤除去保存液，实施总RNA提取。本发明提供的动物肌肉组织有机浸润液可以在常温下快速完成肌肉组织的浸润并用于后续的保存，与传统的水相保存液相比，浸润时间缩短了 10倍以上。本发明提供的动物肌肉组织RNA有机相保存液具有配制简单，成本较低，使用方便的特点。同时，本发明提供的保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，不但降低了 RNA提取对于动物肌肉组织的保存要求，方便样品采集，还可以把因为样品RNA降解的原因造成的实验失败率降到最低，为实验的准确性提供保障，为获得高质量的RNA及相关技术的研究奠定基础。
图1从本发明所述方法保存不同时间的鸡肌肉组织中提取总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测結果。其中，泳道I为从未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总RNA ;泳道2为从常温下保存48小时鸡肌肉组织提取的总RNA ;泳道3为从4摄氏度保存I周鸡肌肉组织提取的总RNA ;泳道4为从液氮中保存I年鸡肌肉组织提取的总RNA。图2以从本发明所述方法保存不同时间的鸡肌肉组织中提取总RNA为模板，利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增鸡￠-肌动蛋白基因并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测的結果。其中，泳道I为以从未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道2为以从常温下保存48小时鸡肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道3为以从4摄氏度保存I周鸡肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道4为以从液氮中保存I年鸡肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果，泳道5为D2000分子量标记。图3从本发明所述方法保存不同时间的牛肌肉组织中提取总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测結果。其中，泳道I为从未经保存的新鮮牛肌肉组织提取的总RNA ;泳道2为从常温下保存48小时牛肌肉组织提取的总RNA ;泳道3为从4摄氏度保存I周牛肌肉组织提取的总RNA ;泳道4为从液氮中保存I年牛肌肉组织提取的总RNA。图4以从本发明所述方法保存不同时间的牛肌肉组织中提取总RNA为模板，利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增牛￠-肌动蛋白基因并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测的結果。其中，泳道I为以从未经保存的新鮮牛肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道2为以从常温下保存48小时牛肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道3为以从4摄氏度保存I周牛肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果；泳道4为以从液氮中保存I年牛肌肉组织提取的总RNA为模板的扩增结果，泳道5为D2000分子量标记。
具体实施例方式下面通过式实例来进ー步阐明本发明，这些实施例仅在于说明本发明而绝不限制 本发明。实施例1鸡的肌肉组织中RNA的保存以取自刚孵化出的汶上芦花鸡腿部的肌肉组织为例。浸润液的配置将9. 5ml甲醇与0. 5mlこ醇充分混匀，置于室温待用。保存液的配置将0. 2mg三氯こ酸溶于IOmlこ醇中，振荡至固体完全溶解，配制成三氯こ酸母液；将9. 79mlこ醇，0. 2ml甲醇和0. Olml三氯こ酸母液充分混匀，置于室温待用。将新鲜采集的鸡的肌肉组织样品切成边长为5mm小块，使用0. 125ml浸润液冲洗一次，将样品置于0. 375ml的浸润液中室温放置I小时；过滤除去浸润液；将样品置于
0.8ml的保存液中，密封于样品瓶中。分别在常温下保存24小吋，4摄氏度保存I周和置于液氮中保存I年后取出样品，过滤除去保存液。利用常规的Trizol法提取保存的鸡肌肉组织总RNA :取75mg肌肉组织，加入ImlTrizol (Invitrogen Life Technologies公司)快速充分勻衆组织；电动勻衆器采用DEPC水配制的75%こ醇处理除去RNase，室温静置5min，使其充分裂解；加入氯仿0. 2ml，用力振摇，室温放置3min ；4°C 12，OOOg离心15min，吸取上层水相，移置另ー离心管；加入0. 5ml冷异丙醇，将管中液体混匀，室温静置20min ；4°C 12，OOOg离心lOmin，弃上清；加入75%こ醇(DEPC水配制)1ml，充分洗涤沉淀，4°C 10，OOOg离心5min，弃上清，室温干燥；加入适量的DEPC水溶解RNA。提取的总RNA均利用紫外分管光度计分别检测260nm和280nm的吸光度A260和A280，计算二者的比值。结果为未经保存的新鲜鸡肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 88 ;常温下保存24小时的鸡肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 85 ;4摄氏度保存I周的鸡肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 93 ;置于液氮中保存I年鸡肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 82。纯化的总RNA吸光度A260/A280比值均为1. 8-1. 95，并且不同样本之间无明显差別。提取的总RNA均利用常规的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如附图1所示在所有样品中，28S和18S RNA条带均清晰可见，5S RNA条带也可检测到，并且不同样本之间
无明显差別。提取的总RNA均进行针对管家基因￠-肌动蛋白基因的反转录-聚合酶链式反应扩增，所使用的引物序列为上游引物5’ -CTGACTGACCGCGTTACTCC-3’和下游引物5’-GGGGTACTTCAGGGTCAGGA-3’。然后利用常规的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如附图2所示在所有样品中，长度为241bp的目的产物条带均清晰可见，并且不同样本之间无明
显差别。以上结果表明利用本发明所述的保存动物肌肉组织的方法，可以高效而经济的保存鸡的肌肉组织中的RNA。实施例2牛的肌肉组织中RNA的保存以取自鲁西黄牛的腿部肌肉组织为例。 浸润液的配置将9. 7ml甲醇与0. 3mlこ醇充分混匀，置于室温待用。保存液的配置将0. 35mg三氯こ酸溶于IOmlこ醇中，振荡至固体完全溶解，配制成三氯こ酸母液；将9. 69mlこ醇，0. 3ml甲醇和0. Olml三氯こ酸母液充分混匀，置于室温待用。将新鲜采集的鸡的肌肉组织样品切成边长为5mm小块，使用0. 125ml浸润液冲洗一次，将样品置于0. 4ml的浸润液中室温放置1. 2小时；过滤除去浸润液；将样品置于
0.9ml的保存液中，密封于样品瓶中。分别在常温下保存48小吋，4摄氏度保存I周和置于液氮中保存I年后取出样品，过滤除去保存液。利用常规的Trizol法提取保存的牛肌肉组织总RNA :取75mg肌肉组织，加入ImlTrizol (Invitrogen Life Technologies公司)快速充分勻衆组织；电动勻衆器采用DEPC水配制的75%こ醇处理除去RNase，室温静置5min，使其充分裂解；加入氯仿0. 2ml，用力振摇，室温放置3min ；4°C 12，OOOg离心15min，吸取上层水相，移置另ー离心管；加入0. 5ml冷异丙醇，将管中液体混匀，室温静置20min ；4°C 12，OOOg离心lOmin，弃上清；加入75%こ醇(DEPC水配制)1ml，充分洗涤沉淀，4°C 10，OOOg离心5min，弃上清，室温干燥；加入适量的DEPC水溶解RNA。。提取的总RNA均利用紫外分管光度计分别检测260nm和280nm的吸光度A260和A280,计算二者的比值。结果为未经保存的新鲜牛肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 7 ;常温下保存48小时的牛肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 86 ；4摄氏度保存I周的牛肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 78 ;置于液氮中保存I年牛肌肉组织提取的总RNA的0D260/280值为1. 79。纯化的总RNA吸光度A260/A280比值均为
1.7-1. 9，并且不同样本之间无明显差別。纯化的总RNA均利用常规的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如附图3所示在所有样品中，28S和18S RNA条带均清晰可见，并且不同样本之间无明显差別。纯化的总RNA均进行针对管家基因￠-肌动蛋白基因的反转录-聚合酶链式反应扩增，所使用的引物序列为上游引物5’ -CACCCCGCTTCTCTCTAAGGA-3’和下游引物5’ -CTCAACCCGCTCCCAAGG-3’。然后利用常规的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如附图4所示在所有样品中，长度为233bp的目的产物条带均清晰可见，并且不同样本之间无明显差另1J。
以上结果表明利用本发明所述的保存动物肌肉组织的方法，可以高效而经济的保 存牛的肌肉组织中的RNA。
权利要求
1.一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液，所述保存液由乙醇、甲醇和三氯乙酸配比而成，其特征在于所述乙醇含量以体积百分比计占保存液总体积的95、9%，所述甲醇含量以体积百分比计占保存液总体积的1飞％，所述三氯乙酸含量以质量百分比计占保存液总质量的O. f 1%。
2.如权利要求1所述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的保存液，其特征在于所述保存液中乙醇含量以体积百分比计占保存液总体积的96. 5 98%，所述甲醇含量以体积百分比计占保存液总体积的2 3. 5%，所述三氯乙酸含量以质量百分比计占保存液总质量的O.2 O. 35%。
3.一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液，所述浸润液由甲醇和乙醇配比而成，其特征在于所述甲醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的90、9%，所述乙醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的广10%。
4.如权利要求3所述用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的浸润液，其特征在于所述浸润液中甲醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的95、8%，所述乙醇含量以体积百分比计占浸润液总体积的2 5%。
5.一种保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，步骤是将新鲜采集的动物肌肉样品切成粒径不大于IOmm的块状，用其等体积量的权利要求3所述的浸润液冲洗1_2次，然后转到体积量为其体积2-5倍的浸润液中，室温放置O. 5-2小时；之后过滤除去浸润液；将除去浸润液的样品置于含有其3-10倍体积量的权利要求1所述保存液的瓶中，密封瓶口，常温下保存动物肌肉组织24-48小时；或4°C保存动物肌肉组织1-2周；或者置于液氮中保存动物肌肉组织1-1. 5年。
6.如权利要求5所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，其特征在于所述样品切成粒径为4-5mm的块状。
7.如权利要求5所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，其特征在于所述用于浸润样品的浸润液使用体积量选择样品体积的3-4倍，室温放置时间为1-1. 2小时。
8.如权利要求5所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，其特征在于所述用于保存样品的保存液使用体积量选择样品体积的5-8倍。
全文摘要
本发明公开了一种用于保存动物肌肉组织中核糖核酸的试剂及应用方法，所述试剂包括保存液和浸润液，利用所述有机相试剂可快速浸润和处理肌肉组织样品，实现高效而经济的保存其中核糖核酸组分的目的。同时，本发明所提供的保存液具有配制简单，成本较低，使用方便的特点，且本发明所述保存动物肌肉组织中核糖核酸的方法，不但降低了核糖核酸提取对于动物肌肉组织的保存要求，方便样品采集，还可以把因为核糖核酸降解的原因造成的实验失败率降到最低，为实验的准确性提供保障，为之后获得高质量的核糖核酸及进行相关研究奠定基础。
文档编号C12N15/10GK103013983SQ20121059477
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者林浴霜, 胡玮 申请人:山东大学