与椎间盘退行性病变相关的微小rna的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及miR-744在诊治椎间盘退行性病变中的用途。
【背景技术】
[0002] -系列调查表明：在西方工业社会，12% -35%的人患有下腰痛，其中10%已丧失 劳动能力。美国最新统计显示，因下腰痛造成的直接医疗支出和间接损失保守估计为每年 196亿美元，给社会医疗带来沉重负担。椎间盘退行性变是引起下腰痛的主要原因，它与坐 骨神经痛和椎间盘突出、脱垂等疾病关系密切。
[0003] 人微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单 链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发 育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着 紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核 糖核酸的表达水平均有不同程度的下调（LawrieCH，GalS，DunlopHMetal.Detection ofelevatedlevelsoftumor-associatedmicroRNAsinserumofpatientswith diffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol2008;141:672-675);分析比较人肺 癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时，发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水 平相对于正常组织发生了变化（GarofaloM，QuintavalleC，DiLevaGetal.MicroRNA signaturesofTRAILresistanceinhumannon-smallcelllungcancer.Oncogene 2008) ^也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的 发生和发展，并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联（TryndyakVP，RossSA，Beland FA，PogribnyIP.Down-regulationofthemicroRNAsmiR-34a，miR_127,andmiR_200bin ratliverduringhepatocarcinogenesisinducedbyamethyl-deficientdiet.Mol Carcinog. 20080ct21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和 发展之间存在着必然联系。
[0004]由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它 与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制 因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表 达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通 路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是 因为当疾病发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若 微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。
[0005] 因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性 变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点，通 过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸，将有可能极大地缓 解疾病的发生和发展。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断椎间盘退行性病变的微小RNA 标记物。
[0007] 本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种微小RNA在制备椎间盘退行性病变诊断工具中的应用，所述微 小RNA选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人细胞内被剪切 并表达成成熟miRNA;前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA;所述微小RNA 是miR_744。
[0010] 应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突 变。
[0011] 本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两 端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的 功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-744功能的条件下，对miR-744进行碱基 修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0012] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-744是成熟miR-744。
[0013] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预 期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一 步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
[0014] 本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单 链形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、 DNA、PNA、LNA的形式。
[0015] 进一步，上述诊断工具包括但不限于，芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述 诊断工具包括用于检测miR-744的表达水平的试剂。
[0016] 进一步，所述试剂盒包括针对miR-744的引物和/或探针；所述芯片包括固相载 体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于 miR-744的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-744的引物和/或探针；所述高通量测 序平台包括针对miR-744的引物和/或探针。
[0017] 本发明提供了 一种椎间盘退行性病变的诊断工具，所述诊断工具包括检测 miR-744表达水平的试剂。
[0018] 进一步，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
[0019] 进一步，所述试剂盒包括针对miR-744的引物和/或探针；所述芯片包括固相载 体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于 miR-744的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-744的引物和/或探针；所述高通量测 序平台包括针对miR-744的引物和/或探针。
[0020] 进一步，所述试剂盒中的针对miR-744的引物和/或探针还可包括针对现有技术 中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小 RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断椎间 盘退行性病变的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0021] 进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道 的可用于检测miR-744的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一 芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断椎间盘退行性病变也包含在本发明的保护范围 之内。
[0022] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醛基、氨基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0023] 所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡 核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序 列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》； J.L.erisi?V.R.Iyer?P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science，1997 ;278 :680和马立人，蒋中华主编·生 物芯片.北京：化学工业出版社，2000,1-130。
[0024] 本发明的miR-744可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-744的 DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
[0025] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0026] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3. 0表达载体、pcDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0027] 可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序 列信息，根据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区 间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
[0028] 药物筛选：在得知了前面所述的miR-744与椎间盘退行性病变的密切相关性后， 可以基于该特征来筛选促进miR-744表达的物质。之后，可从所述的物质中找到对于治疗 椎间盘退行性病变真正有用的药物。
[0029] 因此，本发明还提供了一种