一种用于人体移植的生物椎间盘的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于人体移植的生物椎间盘，其制备步骤如下：以遗体捐献者为椎间盘为供体，无菌条件下获取椎间盘备用；将髓核组织用胶原酶进行消化，离心后用PBS漂洗离心，于细胞培养箱中培养；取第2代细胞接种于细胞培养板，饱和湿度培养；用hBMP7基因转染所述髓核细胞，收集备用；用注射器将获得的转染后髓核细胞悬液注入所述椎间盘。本发明构建的生物活性人工椎间盘，能明显改善目前用于椎间盘退变性疾病的植入材料的临床效果，能显著改善患者的临床症状，并能有效预防远期发生的相关并发症。
【专利说明】一种用于人体移植的生物椎间盘
【技术领域】
[0001]本发明属于医用材料【技术领域】，具体涉及一种可用于人体移植的具有生物活性的椎间盘。
【背景技术】
[0002]椎间盘退行性变化是引起成人腰腿痛、颈肩痛的主要原因。随着人均寿命的延长和社会工作压力增大，椎间盘退变性疾病的发病率明显升高，而目前的保守治疗和外科手术治疗均不能从根本上解决患者的病情。目前应用于退变椎间盘的人工植入材料主要为钛合金类材料，这类植入材料需要将患者自体骨与其共同植入，待其与上下椎体骨性融合后发挥治疗作用。这种植入材料存在植入体内不融合，植入物下沉、感染等手术并发症。长期随访发现，这种植入材料存在脊柱活动度下降、相邻椎间盘加速退变的缺点。为了克服人工材料制备的椎间盘植入物所存在的缺点，当代骨科医学界探索以组织工程方法制备椎间盘植入物。但目前应用组织工程方法仅能构建椎间盘的一部分，例如髓核或者纤维环，还不具备将单独构建的髓核或者纤维环组装构建为完整椎间盘的技术，与临床应用距离尚远。因此，众多因退变而切除椎间盘的患者亟需医疗适应性良好的椎间盘植入物。以生物工程方法制备完整椎间盘植入物在理论上是一种理想的方法，但目前还没有可供临床使用的生物工程椎间盘。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是:采用生物学技术制备一种可用于人类同种异体移植的，具有生物活性的椎间盘组织，称为“生物椎间盘”。这种生物椎间盘能够有效地保留目标椎间盘的活动度，避免相邻椎间盘加速退变的问题，以克服目前临床广泛使用的人工椎间盘植入材料的不足。
[0004]本发明提供一种用于人体移植的生物椎间盘，其制备步骤如下:
步骤一:采集椎间盘:以遗体捐献者为椎间盘供体，无菌条件下采集标本椎间盘若干个备用，所述标本椎间盘包括髓核、纤维环、软骨终板和两端0.4-0.6mm的软骨下板；
步骤二:髓核细胞的转染:将所述椎间盘的髓核组织用胶原酶进行消化，于细胞培养箱中培养；取第2代细胞接种于细胞培养板，饱和湿度培养；用hBMP7转染所述髓核细胞，收集备用；
步骤三:生物活性椎间盘的体外构建:用注射器将步骤二获得的转染后的髓核细胞悬液注入步骤一所述的椎间盘，制得用于人体移植的生物椎间盘。
[0005]制备本发明生物椎间盘的具体步骤如下:
步骤一:冷冻标本椎间盘的制备及储存
经伦理委员会同意，以遗体捐献者的遗体为标本椎间盘供体，无菌条件下采取颈椎、胸椎或腰椎椎间盘。每一个合格的椎间盘标本包括髓核、纤维环、软骨终板和两端
0.4-0.6mm的软骨下板。以生理盐水反复冲洗所收集的标本物,冲洗后立即放入50ml离心管(constar)中，加入含10%FCS和DMSO的DMEM/F12 (1:1)的培养基，置4°C冰箱中过夜，过夜后依次按_20°C 2小时、-40°C 2小时、-80°C 2小时程序置入液氮罐中保存备用。冷冻保存时间应不超过12个月，一般储存期为2-12个月。
[0006]步骤二:髓核细胞的转染
取步骤一制备的椎间盘，摘取其髓核组织作细胞转染用。或者在当代骨科医学经常采用椎间盘摘除术治疗椎间盘突出症的背景下，拾取在通常腰椎手术后摘除而被遗弃的椎间盘，取其髓核组织作细胞转染用。将所取髓核组织无菌环境下用PBS冲洗，以锋利眼科剪剪成约Imm3的组织块，用0.1%的II型胶原酶在37°C的培养箱中消化4小时，3000g离心，PBS漂洗离心3遍，加入含10%FCS的DMEM/F12培养基，于细胞培养箱中培养。取第2代细胞以IXlO5 cell/孔的密度接种于6孔细胞培养板，加入含10% FCS的DMEM培养基2ml，37°C、5% CO2饱和湿度培养约12h。待髓核细胞80%铺满后，弃去上清液，用不含PBS的DMEM培养基洗涤3次。取I孔计数细胞，以I X IO5 V.g/cell的比率，计算所需rAAV2-hBMP7病毒数量，转染剩余5孔的髓核细胞。将所需病毒载体稀释于不含血清的DMEM培养基500 ill内，加入6孔板中，37°C、5% CO2饱和湿度培养约2 h。弃去上清液，DMEM培养基洗涤3次。加入含10% FCS的DMEM完全培养基I ml，37°C、5% CO2培养。用rAAV_hBMP7转染后7天的髓核细胞(NPCs-hBMP7)用PKH-26标记后备用。同法利用rAAV_EGFP病毒载体转染髓核细胞(NPCs-EGFP )，转染后 7 天，收集备用(参见 Wang C，Ruan D, Zhang C.Wang D, Wang DL,Xin H， Zhang Y.Effects of adeno—associated virus-2 mediated human BMP—7 genetransfection on the chondrocytic phenotype of nucleus pulposus cells.J OrthopRes 29， 838， 2011 )。
[0007]步骤三:生物活性椎间盘的体外构建
将转染后髓核细胞制备成浓度为5 X IO5细胞/ml—5 X IO7细胞/ml的细胞悬液，其最佳浓度为5 X IO6细胞/ml，用Iml的注射器连接22G注射针头吸入20-100 细胞悬液备用，其最佳吸入量为50iU。将液氮保存的椎间盘冻存管直接浸泡于35°C _42°C(最佳37°C)水浴箱中，按约100°C/ min速率复温，取出椎间盘组织，PBS洗涤3次。用注射器将细胞悬液注入复温后的人体椎间盘。注入方法为:自椎间盘正中后部纤维环垂直刺入5-7_，以缓慢均匀压力施压，至注射器刻度显示注入20 Ul时，将注射器针头向后退出3_，维持Imin后完全退出。将注射后的椎间盘立刻置入50ml的离心管中，加入30ml完全培养基，竖直置入细胞培养箱中继续培养至7天备用。生物活性组织椎间盘构建如附图1所示。
[0008]通过植入体内验证，将hBMP7基因修饰的髓核细胞同同种异体椎间盘复合后再进行异体移植的方法能明显延缓单纯的同种异体椎间盘移植后的退变性问题。
[0009]本发明具有以下有益效果:本发明构建的生物活性组织椎间盘，能明显改善目前用于椎间盘退变性疾病的植入材料的临床效果，能显著改善患者的临床症状，并能有效预防远期发生的相关并发症。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为构建生物活性椎间盘流程示意图。
[0011]图2为不同移植组椎间盘髓核中hBMP7 PCR电泳图，可见Group A中能表达hBMP7mRNA基因。其中Group A是注射了转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，Group B是注射了未转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，Group C是单纯冷冻椎间盘组。
[0012] 图3为不同移植组X线图，其中A是注射了转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，B是注射了未转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，C是单纯冷冻椎间盘组。
[0013]图4为不同移植组MRI扫描图，其中A注射了转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，B是注射了未转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，C是单纯冷冻椎间盘组。
[0014]图5为不同移植组髓核组织中外源性髓核细胞的荧光图，其中A是注射了转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，B是注射了未转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘组，C是单纯冷冻椎间盘组。
[0015]图6为不同移植组椎间盘的HE及甲苯胺蓝染色，其中Al和A2分别是注射了转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘HE及甲苯胺蓝染色，BI和B2分别是注射了未转染hBMP7基因的髓核细胞的生物工程椎间盘的HE及甲苯胺蓝染色，Cl和C2分别是单纯冷冻椎间盘的及甲苯胺蓝染色。
【具体实施方式】
[0016]下面通过动物实验的描述来进一步阐明本发明。如图1所示，本发明制备具有生物活性的椎间盘分为三个工艺步骤，分别用三个实施例作示例说明。
[0017]实施例1冷冻椎间盘的制备及储存
本实验经海军总医院动物管理中心同意，以Beagle犬为同种异体椎间盘供体，将临床死亡2小时内的犬尸体，在无菌条件下取其腰椎椎间盘，每一个合格的椎间盘标本包括髓核、纤维环、软骨终板和两端0.5mm的软骨下板。生理盐水反复冲洗后，立即放入50ml离心管(constar)中，加入含10%FCS和DMSO的DMEM/F12 (1:1)的培养基。立即置入4°C的冰箱中过夜，过夜后依次按_20°C 2小时、-40°C 2小时、-80°C 2小时标准置入液氮罐中保存。共制备48只，储存期为2个月，备用。
[0018]实施例2髓核细胞的转染
犬髓核组织取自I年龄beagle犬，无菌环境下用PBS冲洗，锋利眼科剪剪成约Imm3的组织块，用0.1%的II型胶原酶在37°C的培养箱中消化4小时，3000g离心，PBS漂洗离心3遍，加入含10%FCS的DMEM/F12培养基，于细胞培养箱中培养。取第2代细胞以I X IO5 cell/孔的密度接种于6孔细胞培养板，6个复孔，DMEM培养基(含10% FCS), 37°C、5% CO2饱和湿度培养约12h。待髓核细胞80%铺满后，弃去上清液，用不含PBS的DMEM培养基洗涤3次。取I孔计数细胞，以IX IO5 V.g/cell的比率，计算所需rAAV2-hBMP7病毒数量，转染剩余5孔的髓核细胞。将所需病毒载体稀释于不含血清的DMHM培养基500 ill内，加入6孔板中，37°C、5% CO2饱和湿度培养约2h。弃去上清液，DMEM培养基洗涤3次。加入DMEM完全培养基(含 10% FCS)Iml, 370C 5%C02 培养。用 rAAV_hBMP7 转染后 7 天的髓核细胞(NPCs_hBMP7)用PKH-26标记后备用。同法利用rAAV-EGFP病毒载体转染髓核细胞(NPCs_EGFP)，转染后7天，收集备用。
[0019]实施例3生物活性椎间盘的体外构建及培养构建前用标记美蓝观察注入悬液在椎间盘内的分布情况。注入的细胞悬液量为20ul。将获得的转染后髓核细胞制备成5X IO5 cell/ml,5X106cell/ml和5X 107cell/ml的细胞悬液，对照组细胞制备成5X106cell/ml的细胞悬液。用Iml的注射器连接22G注射针头，分别将不同浓度的细胞悬液吸入备用。将液氮保存的椎间盘冻存管直接浸泡于37°C水浴中复温(复温速率约100°C / min)，取出椎间盘组织，PBS洗涤3次。注入不同浓度髓核细胞悬液。注入方法为:自椎间盘正中后部纤维环垂直刺入5-7mm，以缓慢均匀压力施压，至注射器刻度显示注入20 Ul时，将注射器针头向后退出3_，维持Imin后完全退出。将注射后的椎间盘立刻置入50ml的离心管中，加入30ml完全培养基，竖直置入细胞培养箱中继续培养至7天备用。 [0020]实施例4应用实验
方法:将18个按实施例1方法制备的犬椎间盘置于冻存液中于_196°C冷冻保存2m，随机分为A、B、C三组，A组以rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞，将能够表达hBMP7蛋白的I X 105髓核细胞于20ul DMEM/F12培养基中注射入复温后椎间盘中，体外培养至7天；B组以相同数量未转染髓核细胞注入椎间盘后体外培养；C组以20 Ul生理盐水注射后体外培养。将培养7天的A、B、C三组椎间盘分别移植至18只Beagle犬L4-5椎间盘，在术前、术后2w、lm,3m和6m通过DR检测移植椎间盘愈合情况及移植椎间盘高度随时间的变化情况；而在术后的lm、3m和6m通过检测移植间盘髓核组织的MRI T2像来分析椎间盘的退变情况；将动物饲养至术后6m时处死取材，对新鲜的腰椎进行生物力学检测，通过MTS分析腰椎屈伸、侧弯及扭转的变化；并通过及胶原染色观察移植椎间盘的形态学改变；对于A组和B组椎间盘中注射的髓核细胞再注射前以PKH-26膜染料进行荧光标记，将取材后的部分椎间盘组织进行冰冻切片，通过PKH-26的红色荧光观测注射的外源性髓核细胞的存活情况；取材后通过PCR法检测三组髓核组织中hBMP7 mRNA的表达，结果如图2所示。
[0021]生物椎间盘的疗效观察:DR片检测结果(图3)显示，除C组有I例犬的移植椎间盘出现了跨椎间盘的骨性融合外，其余17例移植椎间盘均与上下椎体愈合，且未见明显的骨刺形成，对植入椎间盘的高度的动态监测显示三组椎间盘高度改变未见差别(P〈0.05)；MRI检测结果(图4)显示:术后Im三组MRI T2像灰度比未见差别，而在3m和6m时，移植椎间盘MRI T2像信号灰度比显示A组>B组>C组(p〈0.05);生物力学检测结果示:当扭矩为3N.m时，A组扭转活动度为5.4±0.8°，8组6.7±0.7°，C组为13.1 ± 1.3°，可见C组的活动度明显大于A组及B组(p〈0.05)，而A组及B组间无统计学差别(p>0.05)，而对屈伸及侧弯活动度检测发现三组间未见统计学差别；PKH-26荧光检测(图5)显示，在A和B组复合髓核细胞的同种异体椎间盘在移植后的6m时，仍可在荧光显微镜下观察到红色荧光的散在表达，证明移植后6m时仍有外源性髓核细胞存活；对三组椎间盘的HE形态学检测结果(图6)发现三组移植间盘结构均有退变性改变，而A组及B组退变性改变明显较C组轻；髓核的胶原染色显示A组髓核组织胶原含量较B组及C组明显增多，B组较C组胶原纤维轻度增多；PCR检测结果显示:6m时A组仍可检测到hBMP mRNA的高表达。
【权利要求】
1.一种用于人体移植的生物椎间盘，其制备步骤如下: 步骤一:采集椎间盘:以遗体捐献者为椎间盘供体，无菌条件下采集椎间盘若干个备用，所述椎间盘包括髓核、纤维环、软骨终板和两端0.4-0.6mm的软骨下板； 步骤二:髓核细胞转染:将所述椎间盘的髓核组织用胶原酶进行消化，于细胞培养箱中培养；取第2代细胞接种于细胞培养板，饱和湿度培养；用hBMP7转染所述髓核细胞，收集备用； 步骤三:生物活性椎间盘的体外构 建:用注射器将步骤二获得的转染后的髓核细胞悬液注入步骤一所述椎间盘，制得用于人体移植的生物椎间盘。
2.按照权利要求1所述的用于人体移植的生物椎间盘，其特征在于，步骤二中，将所述椎间盘的髓核组织剪成Imm3的组织块后用胶原酶进行消化。
3.按照权利要求1所述的用于人体移植的生物椎间盘，其特征在于，储存标本椎间盘的方法为，采集后立即放入添加10%FCS和DMSO的培养基，并置入4°C的冰箱中过夜；过夜后依次按_20°C 2小时、-40°C 2小时、-80°C 2小时程序置入液氮罐中保存备用。
4.按照权利要求1所述的用于人体移植的生物椎间盘，其特征在于，步骤三中的注入方法为，自所述椎间盘正中后部纤维环垂直刺入5-7_，以缓慢均匀压力施压，至注射器刻度显不注入20 y I时将注射器针头向后退出3mm，维持Imin后完全退出；将注射后的椎间盘立刻置入完全培养基中，竖直置入细胞培养箱中继续培养至7天备用。
5.按照权利要求3所述的用于植入体内的生物椎间盘，其特征在于，所述培养基中添加10%FCS和DMSO的毫升数比例1:1。
6.按照权利要求1所述的用于植入体内的生物椎间盘，其特征在于，步骤二用于髓核组织消化的胶原酶为0.1%的II型胶原酶。
【文档编号】A61L27/38GK103550829SQ201310592291
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】阮狄克, 王超峰, 何勍, 张超, 王德利, 李威, 白雪东, 李海峰, 张燕 申请人:中国人民解放军海军总医院