伦2100测定RNA浓度、纯度和完 整性）。质量鉴定好的RNA存放在-80°C冰箱待用。
[0070] 3、逆转录：
[0071]采用TAKARA公司的反转录试剂盒（DRR047)，对1μgRNA进行反转，该试剂盒较传 统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的 特异性。反应体系和反应条件参照试剂盒说明书进行。
[0072] 4、QPCR反应：
[0073] 以cDNA为模板，使用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)PremixEx TaqTM荧光定量PCR体系，在stratagenMX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct 值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中 的目标miRNA的含量。U6基因作为内照对miRNAqPCR检测结果进行标准化校正。
[0074] 针对miR-744的引物如下：
[0075]正向引物为 5'-TGCGGGGCTAGGGCTAACAGCA-3'（SEQIDNO. 1)，
[0076] 反向引物为通用反向引物（购自北京旷博生物技术有限公司）。
[0077] 针对U6的引物如下：
[0078]正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（SEQIDN0.2)，
[0079]反向引物：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQIDNO.3)。
[0080] 5、结果
[0081] 如图1所示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中miR-744的表达水平 显著降低，与Solexa测序结果一致。
[0082] 实施例3干扰miR-744表达
[0083] 1、设计合成针对miR-744的反义寡核苷酸（anti-miR-744)
[0084]在miRNA数据库（http://www.sanger.ac.uk)中找到miR-744 的序列信息，根据 miR-744的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成anti-miR-744和随机对照 序列（anti-miR-NC) 〇
[0085] 2、细胞培养
[0086] 正常椎间盘髓核组织放入盛有10ml2%II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器 搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10%胎牛 血清的DMEM培养基lml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM培 养基6-8ml，静置于37°C、饱和湿度、5%C0J?箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞 贴壁生长情况，隔天换液。
[0087]3、细胞转染
[0088] 将髓核细胞分为2组，分别为对照组（anti-miR-NC组）、miR-744干扰组 (anti-miR-744组），将髓核细胞运用转染试剂LipofectamineTM2000进行转染，转染方法 参照说明书。反义寡核酸的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
[0089] 4、QPCR实验
[0090] 细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例2。
[0091] 5、结果
[0092] 如图2所示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-744组的细胞内miR-744的水平 显著下调，表明干扰miR-744表达成功。
[0093] 实施例4干扰miR-744表达对髓核细胞增殖的影响
[0094]1、细胞转染：按照实施例3的方法对髓核细胞进行转染。
[0095]2、转染24小时后加入3H-TdR(lμCi/孔），再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁 液，β计数仪检测cpm值。
[0096] 3、统计学方法
[0097] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰miR-744表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0098] 4、结果
[0099] 结果如图3显示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-744组的细胞增殖变慢了，差 异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0100] 实施例5干扰miR-744表达对髓核细胞凋亡的影响
[0101] 1、细胞培养和转染
[0102] 步骤同实施例3。
[0103] 2、凋亡实验：细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25 %胰酶消化 细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为IX106个/ml，取200μL 上述细胞悬液放置到Appendorf管中，加入10μLAnnexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育 染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭（PI)染色5yL。未转染的细胞分别用 Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计 数，观察凋亡细胞百分比。
[0104] 3、统计学方法
[0105] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当 P〈〇. 05时具有统计学意义。
[0106] 4、结果：
[0107]anti-miR-NC组的细胞凋亡率为（9. 25+0. 14) %，anti-miR-744的细胞凋亡率为 (45. 21+1. 94) %，上述差异具有统计学意义（P〈0. 05)，上述结果表明，降低miR-744表达则 会导致细胞凋亡加剧，给予我们的启示是可以通过增加miR-744表达的方式来抑制细胞凋 亡。
[0108] 实施例5干扰miR-744表达对髓核细胞衰老的影响
[0109]SA-β-gal染色检测髓核细胞的衰老情况。SA-β-gal是一种可鉴定衰老细胞的 生物学标志物。按照细胞衰老测定试剂盒（Biovision公司）说明检测，观察并计数显微镜 下细胞质内有蓝色的细胞百分数，判断细胞衰老的情况。每组设3个复孔，每次实验重复3 次。
[0110] 细胞培养和转染同实施例3。
[0111] 细胞转染48h后进行SA- β -gal染色。
[0112] 结果显示，转染anti-miR-NC细胞组蓝色细胞平均百分数为12%，转染 anti-miR-744细胞组蓝色细胞平均百分数为41%，差异具有统计学意义（P〈0. 05)，上述结 果表明降低miR-744表达可以加速髓核细胞的衰老过程，给予我们的启示是可以通过增加 miR-744表达的方式来抑制细胞衰老。
[0113] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.微小RNA在制备椎间盘退行性病变诊断工具中的应用，其特征在于，所述微小RNA 选自以下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA ;初始miRNA能在人细胞内被剪切并表 达成成熟miRNA ;前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA ;所述微小RNA是 miR-744。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-744。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高 通量测序平台。4. 一种椎间盘退行性病变的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括检测权利要求 1所述的微小RNA表达水平的试剂。5.根据权利要求4所述的诊断工具，其特征在于，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试 纸、高通量测序平台。6. 根据权利要求5所述的诊断工具，其特征在于，所述试剂盒包括针对权利要求1所述 的微小RNA的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核 苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于权利要求1所述的微小RNA的部分或全 部序列；所述试纸包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针；所述高通量测序 平台包括针对权利要求1所述的微小RNA的引物和/或探针。7.权利要求1所述的微小RNA在制备治疗椎间盘退行性病变的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的微小RNA 的促进剂。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进剂能够促进权利要求1所述的微 小RNA的表达、或者能够促进权利要求1所述的微小RNA的稳定性、或者能够促进权利要求 1所述的微小RNA的活性、或者能够促进权利要求1所述的微小RNA的有效作用时间。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述促进剂选自以下组：蛋白、寡核 苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。
【专利摘要】与椎间盘退行性病变相关的微小RNA。本发明公开了miR-744在制备椎间盘退行性病变诊断工具中的应用。本发明利用测序和QPCR实验证明miR-744在正常对照组织和椎间盘退行性病变组织中的表达存在差异，因此认为miR-744是诊断椎间盘退行性病变的分子标志物。本发明通过体外培养的细胞实验证明干扰miR-744表达可以抑制髓核细胞的增殖，并促进其衰老、凋亡，因此认为miR-744是治疗椎间盘退行性病变的药物靶标。作为一种新的椎间盘退行性病变诊治分子标志物，该分子标志物在临床上具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K45/00, A61P19/08, C12Q1/68
【公开号】CN105420376
【申请号】CN201510983193
【发明人】杨承刚, 边洋
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月24日