Adamts-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及ADAMTS-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的 应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内，胃癌的发病率居第四位，死亡率居 第二位，仅次于肺癌，我国是胃癌的高发大国，而且胃癌已经呈现年轻化趋势。目前治疗胃 癌的主要方式有手术、化疗和放疗。尽管随着医学科技的发展，早期胃癌的治疗效果己有很 大的提高，但是进展期胃癌患者生存率仍然很低，5年生存率低于30 %，术后复发和远处转 移是胃癌患者死亡的主要原因。寻求更新的胃癌治疗手段特别是基因靶向治疗迫在眉睫， 胃癌的发生是多因素，多基因共同参与的过程，其中癌基因的激活和过度表达在胃癌发生 发展过程中起着关键的作用。
[0003] 人类含I型血小板结合蛋白基序（TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS)家族 由19个分泌型多结构域锌指金属蛋白酶组成，参与多种生理或病理学过程，包括胞外基质 的组装和降解、止血过程、器官生成、人类遗传性疾病、关节炎和癌症等。已有报道显示在非 小细胞肺癌中ADAMTS-1基因下调，在头颈鳞状癌中，ADAMTS-1、ADAMTS-8和ADAMTS-15蛋 白酶的表达明显升高，并且ADAMTS-1、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9和ADAMTS-15蛋白酶 的基因表达与肿瘤侵袭有关。但是有关ADAMTS-2基因的功能研究较少。
[0004] 随着生物技术的发展，实验研究产生了大量的基因芯片数据，并通过基因表达芯 片来筛选出影响疾病发生发展的基因及信号通路，已鉴别出大量差异表达的基因。但是不 同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存在很多不一致性，整合分析可 对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上的整合，以期获得更准确或更 多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免单个研究带来的不正确性。发 明人通过对GE0数据库检索筛选得到6套胃癌表达数据，利用各种生物学信息分析工具对 数据进行重新加工分析，筛选出ADAMTS-2基因，进一步进行了分子生物学验证，RT-PCR结 果显示，ADAMTS-2基因在胃癌组织中高表达，干扰实验表明，ADAMTS-2-siRNAl能有效降低 ADAMTS-2基因的表达。本发明提供了一个新的胃癌诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种胃癌诊断制剂，所述胃癌诊断制剂是检测ADAMTS-2 基因和/或ADAMTS-2基因的表达产物的诊断制剂。
[0006] 进一步，所述胃癌诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测胃 癌组织中ADAMTS-2基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩 增ADAMTS-2基因的引物；所述的基因芯片中包括与ADAMTS-2基因的核酸序列杂交的探针， 更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测ADAMTS-2基因的上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQIDN0. 9,下游引物序列为SEQIDN0. 10。
[0007] 进一步，直接检测外周血和/或组织中ADAMTS-2基因和/或基因的表达产物。
[0008] 进一步，所述的胃癌的诊断制剂采用免疫方法检测胃癌组织中ADAMTS-2基因的 表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
[0009] 进一步，所述检测ADAMTS-2表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所 述试剂盒中的抗体可采用市售的ADAMTS-2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被 ADAMTS-2单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液， 洗涤液，酶反应终止液等。
[0010] 进一步，所述检测ADAMTS-2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采 用市售的ADAMTS-2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技 术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点 有抗ADAMTS-2单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0011] 本发明的目的在于提供上述胃癌诊断制剂在制备胃癌诊断工具中的应用。
[0012] 本发明的目的在于提供一种治疗胃癌的制剂，所述制剂中含有抑制ADAMTS-2基 因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
[0013] 进一步，所述治疗胃癌的制剂中含有激活ADAMTS-2的抑制基因、激活抑制 ADAMTS-2表达的蛋白、导入抑制ADAMTS-2转录或表达的siRNA、激活促进ADAMTS-2mRNA 降解的microRNA、导入促进ADAMTS-2蛋白降解的分子、抑制促进ADAMTS-2表达的因子及蛋 白的表达。
[0014] 优选的，所述治疗胃癌的制剂含有下列中的一组或几组siRNA:SEQIDNO.1和SEQ IDN0.2、SEQIDN0.3和SEQIDN0.4、SEQIDN0.5和SEQIDN0.6。更优选的，所述治疗 胃癌的制剂含有siRNA序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。
[0015] 本发明的目的在于提供上述治疗胃癌的制剂在制备胃癌治疗药物或试剂中的应 用。
[0016] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选 基因ADAMTS-2基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了ADAMTS-2基因与胃癌的关系： ADAMTS-2基因在外周血中高表达，与胃癌具有很好的相关性，可用于制备胃癌辅助诊断制 剂，具有重要的临床应用价值。
[0017] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用 RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的 基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
[0018]RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸 I丐共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0019] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0020] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0021] 本发明的目的在于提供一种检测胃癌的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因 ADAMTS-2,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDN0. 9,下游引物序列 为SEQIDN0. 10。
[0022] 进一步，该PCR试剂盒