Lmnb2基因及其表达产物作为鼻咽癌的诊治靶标的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及LMNB2基因在鼻咽癌的诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌原发于鼻咽粘膜被覆上皮的恶性肿瘤。是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性 变频高，自然生存时间平均为18. 7个月。中国的广东、广西、福建、湖南等地为多发区，男多 于女。发病年龄大多为中年人，亦有青少年患病者。病因与种族易感性（黄种人较白种人 患病多）、遗传因素及EB病毒感染等有关，鼻咽癌恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结 转移。
[0003] 鼻咽癌的发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶部者，早期症状不明显，因此难 以早期发现，误诊误治率较高。鼻咽癌5年生存率近年来一直徘徊在50%左右，而鼻咽癌早 期确诊病人五年生存率可达90%，因此对鼻咽癌进行高危人群筛查和早期诊断，以便进行 早期治疗，可显著提高患者生存率。
[0004] 目前鼻咽癌的早期检测方法有多种，包括EB病毒血清学标志物、鼻咽癌相关肿瘤 标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间粘附因子以及端粒酶等的检测。虽然这些指标 的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，但是它们缺乏足够的灵敏度和特异 性。因此寻找一种灵敏度和特异性高的用于鼻咽癌早期诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于鼻咽癌早期诊断的 分子标志物。相比现有的鼻咽癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断鼻咽癌的具有及时性、 特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预 防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了检测LMNB2基因表达的产品在制备诊断鼻咽癌的工具中的应用。
[0008] 进一步，所述检测LMNB2基因表达的产品包括检测LMNB2基因mRNA水平的产品、 和/或检测LMNB2蛋白水平的产品。
[0009] 进一步，所述检测LMNB2基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 测、原位杂交或芯片检测LMNB2基因表达以诊断鼻咽癌的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增LMNB2基因的引 物；所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括一对特异扩增LMNB2基因的引物；所 述用免疫检测诊断鼻咽癌的产品包括：与LMNB2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交 诊断鼻咽癌的产品包括：与LMNB2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断鼻咽癌的 产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与LMNB2蛋白特异性结合的抗体，基 因芯片包括与LMNB2基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 所述用实时定量PCR诊断鼻咽癌的产品至少包括的一对特异扩增LMNB2基因的引 物如SEQIDN0. 3 和SEQIDN0. 4 所示。
[0012] 所述检测LMNB2基因表达的产品可以是检测LMNB2基因表达的试剂、也可以是包 含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0013] 所述诊断鼻咽癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高 通量测序平台是一种特殊的诊断鼻咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的 基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知LMNB2基因的异常与 鼻咽癌相关也属于LMNB2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0014] 本发明还提供了一种诊断鼻咽癌的工具，所述工具包括检测LMNB2基因表达的试 剂；所述试剂包括检测LMNB2基因mRNA的引物和/或探针、检测LMNB2蛋白的抗体。
[0015] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0016] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LMNB2基因转录水平的针对 LMNB2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的LMNB2 蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括LMNB2基因在内的多个基因（例如，与鼻 咽癌相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括LMNB2蛋白在内的多 个蛋白质（例如与鼻咽癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与鼻咽癌的标志物 同时检测，可大大提高鼻咽癌诊断的准确率。
[0017] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测LMNB2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括LMNB2蛋白 的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯 片方法检测LMNB2基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对LMNB2基 因的引物和/或探针。根据LMNB2基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测LMNB2 基因表达水平的引物和探针。
[0018] 所述试纸包括检测LMNB2基因表达的试剂。
[0019] 所述高通量测序平台包括检测LMNB2基因表达的试剂。
[0020] 与LMNB2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0021 ] 进一步，所述LMNB2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述LMNB2 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与LMNB2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0022] 在本发明的具体实施方案中，所述检测LMNB2基因mRNA的引物包括SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4所示的引物对。
[0023] 本发明还提供了LMNB2基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗鼻咽癌的药物 中的应用。所述抑制剂包括抑制LMNB2基因表达的试剂、和/或抑制LMNB2基因表达产物 的试剂。
[0024] 进一步，所述抑制LMNB2基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻 译的试剂；所述抑制LMNB2基因表达产物的试剂包括抑制LMNB2基因mRNA的试剂、抑制 LMNB2蛋白的试剂。所述抑制LMNB2基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制 mRNA翻译活性的试剂。所述抑制LMNB2蛋白的试剂包括抑制LMNB2蛋白稳定性的试剂、抑 制LMNB2蛋白活性的试剂、抑制LMNB2蛋白功能的试剂。
[0025] 进一步，抑制LMNB2基因mRNA的试剂包括针对LMNB2基因mRNA的双链核糖核酸； 抑制LMNB2蛋白功能的试剂包括LMNB2抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制LMNB2蛋白功能的抗体。 所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
[0026] 在本发明的具体实施方案中，所述针对LMNB2基因mRNA的双链核糖核酸是 siRNA。为了确保LMNB2基因能够被高效剔除或沉默，根据LMNB2基因的mRNA序列设计 了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashiret.al2001， Schwarzet.al2003,Khvorovaet.al2003,Reynoldset.al2004,Hsiehet.al2004, Ui-Teiet.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram ofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004,http://jura.wi.mit.edu/bioc/ siRNAext/)和BLOCK-iTTMRNAiDesignerofINVITR0GEN(winnerofthe2004Frost& SullivanExcellenceinResearchAward,https://rnaidesigner.invitrogen.com/ sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于 筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对（NCBIBLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA 片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0027] 优选地，所述siRNA的序列如SEQIDN0.7和SEQIDN0.8所示。
[0028] 本发明还提供了一种用于治疗鼻咽癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所 述的LMNB2基因和/或其表达产物的抑制剂。<