Lilra2基因及其表达产物作为多发性骨髓瘤的诊治靶标的制作方法
【专利摘要】本发明公开了LILRA2基因可以作为多发性骨髓瘤诊断的分子标志物。本发明利用基因芯片和QPCR实验发现LILRA2基因表达产物在正常骨髓组织和多发性骨髓瘤组织中的表达存在显著差异，即可以通过检测骨髓组织中LILRA2基因表达情况来判断受试者是否患有多发性骨髓瘤或者具有患多发性骨髓瘤的风险。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。另外，本发明还公开了LILRA2基因可作为治疗多发性骨髓瘤的分子靶标，为开展多发性骨髓瘤治疗药物的开发工作提供了基础。
【专利说明】
LILRA2基因及其表达产物作为多发性骨髓瘤的诊治革田标
技术领域
[0001] 本发明设及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明设及W检测LILRA2 异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法;及激活LILRA2基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种骨髓内浆细胞异常增生的血液系统 恶性肿瘤性疾病，约占血液恶性肿瘤10 %，好发于老年人，随着我国人口老龄化，MM发病人 数有所增加。其主要特征是克隆性浆细胞异常增生并侵犯骨髓，产生克隆性免疫球蛋白。临 床表现为骨髓瘤细胞增生、浸润和骨髓微环境破坏，导致贫血、出血、骨痛或骨折、高巧症、 肾功能不全及免疫功能低下等。的-MG是多发性骨髓瘤患者常用的临床指标，也是作为国际 分期标准（ISS)的指标之一，的-MG的水平与骨髓瘤患者瘤负荷、预后存在相关性。目前治疗 骨髓瘤主要应用激素、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等，运些药物的治疗可W使MM缓解，但 最终难免复发，因此需要发现新的诊断和治疗策略。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测LILRA2基因或蛋白表达差异来诊断多 发性骨髓瘤的方法。
[0004] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测LILRA2基因或蛋白表达差异来预测多 发性骨髓瘤预后的方法。
[0005] 本发明的目的之Ξ在于提供一种通过激活LILRA2基因或LILRA2蛋白来治疗多发 性骨髓瘤的方法。
[0006] 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗多发性骨髓瘤的药物的方法。
[0007] 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗多发性骨髓瘤的药物。
[000引为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009] 本发明提供了检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品在制备多发性骨髓瘤诊断工 具中的用途。
[0010] 本发明还提供了检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品在制备预测多发性骨髓瘤 预后工具中的用途。
[0011] 进一步，所述检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品包括检测LILRA2基因或LILRA2 蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合LILRA2基因的核酸或者能够结合LILRA2蛋 白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测LILRA2基因的表达水平；所述物质能够检测 LILRA2蛋白的表达水平。
[0012] 本发明的检测LILRA2基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能： 如PCR、如Southern杂交、Nodhern杂交、点杂交、巧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0法、 高通量测序平台等。使用该产品可W定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0013] 包含在上述产品中的核酸可W通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0014] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Ampl if ication RefractoiT Mutation System,扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可W通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核巧酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0015] 上面所述的核酸包括扩增LILRA2基因的引物，产品中包括的引物可W通过通过化 学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过 化学合成来制备。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列)所示。
[0017] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可W通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可W通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0018] 本发明的检测LILRA2蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例 如，可W包括化ISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Wes tern印迹等。
[0019] 本发明的检测LILRA2蛋白的产品包括特异性结合LILRA2蛋白的抗体或其片段。可 W使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合祀蛋白质即 可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可W是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保 留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肤。抗体片段可W 包括F(ab/ )2、化1/、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区 (双抗体）、或含有CDR的肤。本发明的检测LILRA2蛋白的产品可W包括编码抗体或编码抗体 片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0020] 抗体可W通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分祀 蛋白质的多肤或整合编码它们的多核巧酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞W获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可W通过使用被用作抗原的LILRA2蛋白或其部分对获得的抗体实 施抗原特异性纯化来获得针对LILRA2蛋白的单克隆抗体。可W如下制备多克隆抗体：用与 上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使 用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可W通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的 抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0021] 标记物与抗体或其片段的结合可W通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 W如下巧光标记蛋白质或肤：用憐酸盐缓冲液清洗蛋白质或肤，添加用DMS0、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性憐酸酶标记试剂盒诸如碱性憐酸酶标记试剂盒-N肥、碱性憐 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);巧光标记试剂盒诸如巧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte FluoHTM) 555标记试剂盒-N肥、HiLyte Fluo;r(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLi曲t 547和DyLi曲t647(Techno 化emical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluo;r(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Coloration)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(化nakoshi Co巧oration)。为了正确标记，可W使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0022] 作为依照本发明的检测产品的样品，可W使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可W包括组织、血液、血浆、 血清、淋己液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0023] 在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
[0024] 在本发明中，"预后"是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。在本说明书中，预后可W是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可W通过检查生物标志物即LILRA2蛋白或编 码LILRA2蛋白的基因来预测。预后预测可W运样进行:根据生物标志物的有或无，或者升高 或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0025] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可^意 指在运样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可W意指至少3年或尤 其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如 本文中所使用的，"预后良好"还可W包括任何运样的状态，其中可W发现疾病如转移，但是 恶性低且不严重地影响生存能力。
[0026] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期（例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。或者，预后差是指在运样的短时期里死 亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可W意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死 亡。
[0027] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能W100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中LILRA2基因或LILRA2蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患 者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
[002引进一步，所述检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品可W是检测LILRA2基因或 LILRA2蛋白的试剂、也可W是包含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试 剂的高通量测序平台。
[0029]本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的工具，所述工具能够检测LILRA2基因或 LILRA2蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合LILRA2基因的核酸或者能够结合LILRA2蛋 白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测LILRA2基因的表达水平；所述物质能够检测 LILRA2蛋白的表达水平。
[0030] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0031] 进一步，所述诊断多发性骨髓瘤的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通 量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测序技 术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 LILRA2基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于LILRA2基因的用途，同样在本发明的保护范 围之内。
[0032] 本发明还提供了一种预测多发性骨髓瘤预后的工具，所述预测多发性骨髓瘤预后 工具包括能够结合LILRA2基因的核酸或者能够结合LILRA2蛋白的物质(例如抗体）。所述核 酸能够检测LILRA2基因的mRNA水平;所述物质能够检测LILRA2蛋白的表达水平。
[0033] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0034] 进一步，所述预测多发性骨髓瘤预后的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或 高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测 序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者 和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中 获知LILRA2基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于LILRA2基因的用途，同样在本发明的保 护范围之内。
[0035] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗LILRA2抗体或其片段所识别的氨基酸的 数目没有特别限制，只要抗体能够结合LILRA2即可。
[0036] 本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的方法，所述方 法包括如下步骤：
[0037] (1)获取受试者的样品；
[0038] (2)检测受试者样品中LILRA2基因或蛋白的表达水平；
[0039] (3)将测得的LILRA2基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0040] (4)与对照相比，LILRA2基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为多发性 骨髓瘤，或该受试者被确定为预后不良。
[0041] 本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的治疗方法，所述方法包括激活LILRA2基因或 LILRA2蛋白。
[0042] 进一步，所述方法包括促进LILRA2基因的表达，或促进LILRA2蛋白的表达或增强 LILRA2蛋白的活性。
[0043] 本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可W通过在对癌细胞添加测试药物后 或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量LILRA2基因或者LILRA2蛋白的表达 水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当LILRA2基因或者LILRA2蛋白的 表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿 瘤预后的治疗药物。
[0044] 本发明还提供了一种含有LILRA2基因或LILRA2蛋白的激活剂的药物。
[0045] 本发明还提供了上述激活剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
[0046] 本发明的LILRA2基因或LILRA2蛋白的激活剂不受限制，只要是可W促进或者增强 LILRA2或设及LILRA2上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即 可。
[0047] 进一步，所述激活剂包括LILRA2基因、LILRA2蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控 因子、或促进型祀向小分子化合物。
[004引所述激活剂还包括包含携带LILRA2基因的载体或者宿主细胞。
[0049] 本发明的激活剂一方面可W用于补充内源性的LILRA2蛋白的缺失或不足，通过提 高LILRA2蛋白的表达，从而治疗因 LILRA2蛋白缺乏导致的多发性骨髓瘤。另一方面可W用 于增强LILRA2蛋白的活性，从而治疗多发性骨髓瘤。
[0050] 本发明的药物可W作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可W与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可W包括例如烧化剂，诸如异环憐酷胺、环憐酷 胺、达卡己嗦、替莫挫胺、尼莫司汀、白消安、丙卡己阱、美法仑、和雷莫司汀;抗代谢物，诸如 依诺他滨、卡培他滨、卡莫氣、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞巧、阿糖胞巧十八烷基憐酸盐 (cy^rabine ocfos化te)、替加氣、替加氣-尿喀晚、替加氣吉美喀晚奥替拉西钟、去氧氣尿 巧、径基脈、氣尿喀晚、氣达拉滨、培美曲塞、喷司他下、琉嚷岭、和甲氨蝶岭;植物生物碱，诸 如伊立替康、依托泊巧、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和 长春碱;抗癌抗生素，诸如放线菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他下 stimalamer、柔红霉素、多柔比星、化柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素 C、和米托蔥酿； 基于销的药物，诸如奥沙利销、卡销、顺销、和奈达销;激素药物，诸如阿那曲挫、依西美坦、 雌莫司汀、烘雌醇、氯地孕酬、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氣他胺、 泼尼松龙、憐雌酪、米托坦、甲睾酬、甲径孕酬、美雄烧、亮丙瑞林、和来曲挫；生物反应修饰 剂，诸如干扰素 α、干扰素 β、干扰素丫、白介素、乌苯美司、干BCG、和香茹多糖;和分子祀向药 物，诸如伊马替尼（imatinib)、吉非替尼(旨6門1:;[]1化）、吉姆单抗、奥佐米星、他米己罗汀、曲 妥单抗、维A酸、棚替佐米(bo;rtezomib)、和利妥昔单抗等。
[0051] 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、 舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0052] 本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下 的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，屯、室内，直肠，阴道， 烦骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可W系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
[0053] 本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可 W依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可W使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0054] 在本发明的上下文中，"诊断多发性骨髓瘤"既包括判断受试者是否已经患有多发 性骨髓瘤、也包括判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。
[0055] 本文所用的"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态，并且包括：
[0056] (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾 病状态，但尚未被诊断出患有运种疾病状态时；
[0057] (2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生;或者
[0058] (3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
[0059] 术语"治疗"通常设及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用），其中可达到某些预 期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈 病症。还包括作为预防措施(例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途，也包括在术语"治疗"中。
[0060] 本发明的优点和有益效果：
[0061] 本发明的发现了一种诊断多发性骨髓瘤的分子标志物，使用该分子标志物可W在 多发性骨髓瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0062] 另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
[0063] 本发明的包括LILRA2基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的多发性骨髓瘤 的治疗药物。
【附图说明】
[0064] 图1显示LILRA2基因过表达对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响；
[0065] 图2显示LILRA2基因过表达对多发性骨髓瘤细胞侵袭的影响；
[0066] 图3显示LILRA2基因过表达对多发性骨髓瘤细胞迁移的影响。
[0067] 具体的实施方式
[0068] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0069] 实施例1基因忍片筛选差异表达基因
[0070] 1、取材：
[0071] 多发性骨髓瘤组织:收集确诊的MM患者骨髓活检标本共10例，MM诊断标准参阅《中 国多发性骨髓瘤诊治指南2011修订版》。患者中男5例，女5例，中位年龄59岁。
[0072] 正常骨髓组织:收集同时期营养不良性贫血患者骨髓活检组织标本10例作为对照 组，其中男5例，女5例，中位年龄53岁。
[0073] 2、组织RNA的获取
[0074] 使用Tr i ZO1-步法提取组织总RNA。
[0075] 3、RNA纯度及浓度的测定
[0076] 取RNA溶液1μ1，仪器测定0D260、0D280，RNA浓度为0D260值X稀释倍数X40/ 1000，计算0D260/0D280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20°C保 存。
[0077] 4、RNA完整性检测
[007引 （1)取2μ1 RNA样品行1.5%琼脂糖凝胶电泳(80v，15min);
[0079] (2)分出区带后，genef inder染色，蓝光下观察电泳区带；
[0080] (3)当28s/18s约2:1时，说明RNA稳定无降解。
[0081] 5、基因忍片杂交及扫描
[0082] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，巧光标记后的cRNAs采用歴EASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA化agmen化tion Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱忍片(4x 44K基因），在忍片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0083] 6、忍片数据处理与分析
[0084] 杂交后的忍片经忍片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0085] 7、统计学处理
[0086] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P< 0.05差异有显著性意义。
[0087] 8、结果
[0088] 忍片结果显示，多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组织之间共筛选出489个差异表达 基因，其中表达水平上调的基因215个，表达水平下调的基因274个。
[0089] 实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
[0090] 考虑现有技术中还未见关于该基因与多发性骨髓瘤相关性进行研究的基因作为 候选基因，同时考虑基因测序的结果，选择LILRA2基因（其表达在多发性骨髓瘤组织中下 调)进行验证。
[0091] 1、样本收集
[0092] 按照实施例1的方法收集多发性骨髓瘤组织50例，正常骨髓组织60例。
[0093] 2、在mRNA水平上进行验证
[0094] 2.1提取组织RNA [00M] 步骤同实施例1。
[0096] 2.2逆转录
[0097] 逆转录体系共2化L，包括细胞总RNA化g/化L，50UAiL化asin 1化，5X逆转录反 应缓冲液4化，1〇1111(1饥'?化1，5〇4旨/1^随机引物化1^9'〇1116旨日），2001]/化1-]\0^￥逆转录 酶化L，DEPC祉L。
[0098] 37°C反应60分钟，95°C5分钟终止反应。cDNA在-80°C保存或进行PCR扩增。
[0099] 2.3PCR
[0100] 反应体系按照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒（购自天根生化科技（北京） 有限公司）配置，SYBR反应体系共 25^，2.5ΧΚθ3? Master Mix 10yL，20XSYBR solution 1.2扣L，上游引物0.扣L，下游引物0.扣L，去离子水10.7扣L，cDNA化L。反应条件为94°C 5min，94°C 45s，60 °C Imin，30 个循环，设空白对照。
[0101] PCR反应前10个循环的巧光信号作为巧光本底信号，调苄基线至适宜处，各巧光曲 线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据AC(t) = C(t)a腿H-C(t)e-actin，Δ AC(t) = 2 计算目的基因与β-actin相对表达量。
[0102] PCR引物序列如下：
[0103] LILRA2基因引物序列如下所示：
[0104] 上游引物：5'-TACAGGTGCTATGCTTAT-3'（SEQ ID N0.1);
[0105] 下游引物：5'-GAGTGATGGCTTCTTAGA-3'（沈Q ID N0.2)。
[0106] β-actin基因引物序列如下所示：
[0107] 上游引物：5'-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3'（沈Q ID N0.3);
[010引下游引物：5'-AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3'（SEQ ID N0.4)
[0109] 2.4 结果
[0110] 结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中LILRA2基因的mRNA水平明 显下调，相对表达量为0.11 ± 0.03，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0111] 3、在蛋白水平上进行验证
[0112] 3.1提取组织总蛋白
[0113] 按照化i如化组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0114] 3.2Weste;rn blot检测
[0115] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗解育、二抗解育、 显色。
[0116] 3.3统计学处理
[0117] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，Wi3-actin为内参，将LILRA2蛋 白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[011引 3.4结果
[0119] 结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中LILRA2蛋白水平显著降低， 相对表达量为0.35 ± 0.06，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0120] 实施例化ILRA2基因过表达
[0121] 1、质粒构建
[0122] 根据LILRA2基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟 知。从成人胎脑的cDNA文库klontech公司，货号:638831)中扩增全长的LILRA2基因的编码 序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体PCDNA3.1中，连接获得的重组载体PCDNA3.1- LILRA2用于后续实验。
[0123] 2、多发性骨髓瘤细胞的培养与转染
[0124] 2.1细胞培养
[01巧]RPMI8226细胞采用含有15%胎牛血清(FBS)、青霉素 lOOU/ml、链霉素100μg/ml 的RPMI 1640培养基置于37°C，5%C02,饱和湿度环境下培养。
[0126] 2.2细胞转染
[0127] (1)转染前一天将0.5-巧105个肿瘤细胞悬浮于50化1不含抗生素的培养基，接种 至24孔培养板。
[01%] (2)转染当天细胞密度应达80%-90%，准备W下复合物A:将化g质粒DNA稀释于无 血清培养基中，轻轻混匀；复合物B:取化1 Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混 匀。
[0129] (3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室溫解育。
[0130] (4)将10化1脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37°C 含5 % C〇2培养箱解育5-7小时。
[0131] (5)加 1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小 时。
[0132] 3、利用QPCR实验检测PCDNA3.1-LILRA2的过表达情况
[0133] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0134] 3.2逆转录
[0135] 步骤同实施例2。
[0136] 3.3QPCR
[0137] 步骤同实施例2。
[013引 3.4结果
[0139] 结果显示，PCDNA3.1-LILRA2能够成功过表达，相对表达量为8.16 ± 0.95，差异具 有统计学意义(P<〇.〇5)。
[0140] 3、Western blot实验检测PCDNA3.1-LILRA2过表达情况
[0141] 步骤同实施例2。
[0142] 结果显示，与转染PCDNA3.1组相比，转染PCDNA3.1-LILRA2的细胞中LILRA2蛋白的 含量明显增加，相对表达量为4.43 ± 0.87，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0143] 实施例化ILRA2基因的表达对多发性骨髓瘤细胞增殖能力的测定
[0144] 1、步骤：
[0145] (1)将细胞接种于96孔板中，每个浓度做3复孔；
[0146] (2)加入MTT工作浓度的溶液，与细胞37°C共同解育地；
[0147] (3)除去培养基，加入200μ1二甲基亚讽来溶解甲琐晶体；
[014引 （4)连续5d测0D570,所有实验均重复Ξ次W上，求取平均值；
[0149] 2、结果：
[0150] 结果如图1所示，与转染PCDNA3.1组相比，转染PCDNA3.1-LILRA2组细胞增殖速度 明显减慢，差异具有统计学意义(P<〇.05)。上述实验结果表明，LILRA2基因表达抑制了多发 性骨髓瘤细胞的增殖。
[0151 ] 实施例7检测LILRA2基因表达对细胞迁移、侵袭的影响
[0152] 1、侵袭实验
[0153] 1.1实验步骤：
[0154] (1)上室用Matrigel(人工基底膜)预涂；
[01W] (2)在上室中种入转染后的细胞，接种浓度为5*104/100μ1细胞，在无血清培养基 中培养1她；
[0156] (3)将细胞加入到0.1%的FBS的RPMI-1640培养基中培养1她；
[0157] (4)在冰上吸取 50μ1 Matrigel;
[0158] (5)加入预冷的150μ1无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；
[0159] (6)分别取（5)中混合的Matrigel 50μ1，加入到transwell上室，覆盖整个膜；
[0160] (7)37°C至过夜，使Matrigel聚合成胶；
[0161] (8)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2遍，再加入无血清的RPMI-1640培养基中， 至总体积1〇化1;
[0162] (9)将(8)均匀加入化answe 11上室中，下层培养液和小室间，避免气泡；
[0163] (10)向下室加入 500-600μ1 含 5%FBS的RPMI-1640培养，37°C，5%C02;
[0164] (11)4化后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迁移到膜的下表面的细胞用100%甲醇 固定30min，PBS洗2遍；
[01化](12)0.2%结晶紫染色上室3〇111111少85洗去多余结晶紫；
[0166] (13)倒置显微镜下计数。
[0167] 1.2 结果：
[0168] 实验结果如图2显示，与转染PCDNA3.1组相比，转染PCDNA3.1-LILRA2组细胞侵袭 数明显减少，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0169] 2、迁移实验
[0170] 2.1实验步骤
[0171] (1)上室中不需要预涂Matrigel人工基底膜。在上室中种入转染后的细胞，接种浓 度为(1*105)/10化1个细胞，在无血清培养基中培养18h;
[0172] (2)将细胞加入到0.1%的FBS的无血清RPMI-1640培养基中培养1她；
[0173] (3)在冰上用预冷的枪头吸取50μ1 Matrigel;
[0174] (4)加入预冷的150μ1无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；
[01巧](5)分别取(4)中混合的Matrigel 50μ1加入到Transwell上室，覆盖整个膜；
[0176] (6)37°C至过夜，使Matrigel聚合成胶；
[0177] (7)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2次，再加入无血清的RPMI-1640培养基中， 至总体积1〇化1;
[0178] (8)将(7)均匀加入化answell上室中，下层培养液和小室间，避免气泡，向下室加 入 500-600μ1 含 10%FBS的RPMI-1640培养，37°C，5%C〇2;
[0179] (9)4化后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迁移到膜的下表面的细胞用100%甲醇固 定 30min，PBS洗 2遍；
[0180] (1〇)〇.2%结晶紫染色上室3〇111111少85洗去多余结晶紫；
[0181] (11)倒置显微镜下计数。
[0182] 2.2 结果
[0183] 实验结果如图3显示，与转染PCDNA3.1组相比，转染PCDNA3.1-LILRA2组细胞迁移 数明显减少，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0184] 上述结果表明，LILRA2基因表达抑制了骨髓瘤细胞的迁移和侵袭。
[0185] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品在制备诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓 瘤预后的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的产品 包括检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合LILRA2基因的 核酸或者能够结合LILRA2蛋白的物质;所述核酸能够检测LILRA2基因的表达水平;所述物 质能够检测LILRA2蛋白的表达水平。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增LILRA2基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。5. -种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的工具，其特征在于，所述工具包 括能够检测LILRA2基因或LILRA2蛋白的表达水平的工具。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合LILRA2基因的核酸 或者能够结合LILRA2蛋白的物质;所述核酸能够检测LILRA2基因的表达水平;所述物质能 够检测LILRA2蛋白的表达水平。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增LILRA2基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。8. -种治疗多发性骨髓瘤的药物，其特征在于，所述药物包含LILRA2基因或LILRA2蛋 白的激活剂。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述激活剂能够促进或增强LILRA2或涉及 LILRA2上游或下游途径的物质的表达或活性。10. 权利要求8或9所述的激活剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
【文档编号】G01N33/574GK106011289SQ201610602004
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司