析，根 据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
[0075](三）样品RealTimePCR检测
[0076] 将各样品cDNA10倍稀释后取2μ1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60-95Γ进行溶解曲线分析。
[0077] 二、实验结果
[0078] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产 物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量 公式：2-ACtX100%，比较ADAMTS-2基因在胃癌组和癌旁组中的表达水平。结果显示： qRT-PCR扩增结果稳定，其中ADAMTS-2基因在胃癌组中的表达水平为癌旁组的约2. 5倍，以 上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析ADAMTS-2基因在胃癌患者中高表达的结 果。
[0079] 实施例5RNAi干扰ADAMTS-2表达及对MGC803细胞的影响
[0080] -、材料
[0081] 1.细胞及细胞培养
[0082] 人类胃癌MGC803细胞，购自中国科学院上海细胞库，用含10 %胎牛血清、2mM左旋 谷氨酰胺的RPMI1640培养液置37°C、饱和湿度、5%C02培养箱培养，细胞呈单纯贴壁生长， 每3-5天传代1次。传代时用0. 25%胰蛋白酶消化2-3min，用培养液吹打制成细胞悬液， 按所需浓度接种，接种前经台盼蓝拒染法检测细胞活力。
[0083] 2.siRNA设计与合成
[0084] 依据在线设计软件，根据基因序列参照NCBI:NM_014244. 4 (ADAMTS-2)，设计相应 的siRNA，具体序列见表2。设计后送往上海吉玛制药技术有限公司合成，采用化学合成法， 同时合成随机阴性对照序列和标有荧光标记的通用随机阴性序列，用于计算转染率。
[0085] 表2siRNA序列表
[0086]
[0087] 二、实验方法
[0088] 1.细胞分组
[0089]A组：空白对照；B组：转染siRNAnc的阴性对照组；C1组：转染特异性的 ADAMTS-2-siRNAl组；C2组：转染特异性的ADAMTS-2-siRNA2组；C3组：转染特异性的 ADAMTS-2-siRNA3 组。
[0090] 2.siRNA瞬时转染
[0091]按照Lipofectamine?2000TransfectionReagent提供的步骤进行。焚光显微镜 下观察发绿色荧光的转染阳性细胞。转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值， 细胞的转染效率均达到90%以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
[0092] 转染效率=发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量X100%
[0093] 取对数生长期的MGC803细胞，接种在24孔培养板上，细胞数1X105/孔，分成 空白对照组、转染siRNAnc的阴性对照组、转染特异性的ADAMTS-2-siRNAl、转染特异性的 ADAMTS-2-siRNA2、转染特异性的ADAMTS-2-siRNA3。每孔总体积为 500ul，37°C、5%C02、饱 和湿度下培养24h后的提取mRNA进行检测。
[0094] 3.应用Real-timePCR方法检测转染前后ADAMTS-2基因表达的变化
[0095] (1)标准曲线的构建：选取在50ml培养瓶中正常培养的内皮祖细胞1瓶，提取 RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于 104-10°copies/ul的DNA模板，分别加入ADAMTS-2基因引物和内参引物，配制25ul反应体 系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到ADAMTS-2和内参的标准曲线。
[0096] (2)Real-timePCR方法检测转染前后ADAMTS-2基因表达的变化：提取各组细胞 的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进ADAMTS-2和内参的 Real-timePCR反应，实验重复三次。
[0097] (3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0098] 三、实验结果
[0099] 分别观察各组siRNA转染内皮祖细胞，结果显示在大量内皮祖细胞内发现绿色荧 光，证明内皮祖细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察内皮祖细胞 数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到80%以上。
[0100] Real-timePCR结果显示，空白对照组和转让非特异性的SiRNA的阴性对照组对 内皮祖细胞中ADAMTS-2基因表达无明显抑制作用，二者统计上无显著差异，转染的3个 ADAMTS-2基因siRNA组都对内皮祖细胞中ADAMTS-2基因表达起到一定抑制作用，其中 ADAMTS-2-siRNAl抑制效果最明显，抑制率达64%，具体见图1。
【主权项】
1. 一种胃癌诊断制剂，其特征在于，胃癌诊断制剂是检测ADAMTS-2基因和/或基因的 表达产物的诊断制剂。2. 根据权利要求1所述的胃癌诊断制剂，其特征在于，所述胃癌诊断制剂采用荧光定 量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测胃癌组织中ADAMTS-2基因的表达。3. 根据权利要求2所述的胃癌诊断制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒中含有一对 特异性扩增ADAMTS-2基因的引物；基因芯片中包括与ADAMTS-2基因的核酸序列杂交的探 针；免疫方法中含有ADAMTS-2抗体。4. 根据权利要求2所述的胃癌诊断制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异 性检测ADAMTS-2基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO. 9,下游引物序列 为SEQIDNO. 10。5. 权利要求1-4任意一项所述的胃癌诊断制剂在制备胃癌诊断工具中的应用。6. -种治疗胃癌的制剂，其特征在于，制剂中含有抑制ADAMTS-2基因的转录或表达的 试剂或化合物。7. 根据权利要求6所述的治疗胃癌的制剂，其特征在于，所述治疗胃癌的制剂中含有 激活ADAMTS-2的抑制基因、激活抑制ADAMTS-2表达的蛋白、导入抑制ADAMTS-2转录或表 达的siRNA、激活促进ADAMTS-2mRNA降解的microRNA、导入促进ADAMTS-2蛋白降解的分 子、抑制促进ADAMTS-2表达的因子及蛋白的表达。8. 根据权利要求6所述的治疗胃癌的制剂，其特征在于，所述治疗胃癌的制剂含有下 列中的一组或几组siRNA:SEQIDΝα?和SEQIDN0.2、SEQIDN0.3 和SEQIDN0.4、SEQ IDNO. 5和SEQIDNO. 6,优选的，所述治疗胃癌的制剂含有序列为SEQIDNO. 1和SEQID NO. 2 的siRNA。9. 根据权利要求6所述的治疗胃癌的制剂，其特征在于，制剂中含有药剂学可接受的 载体。10. 权利要求6-9任意一项所述的治疗胃癌的制剂在制备胃癌治疗药物或试剂中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及ADAMTS-2基因及其表达产物在诊治胃癌中的应用。发明人整合已有的基因表达芯片数据，通过对GEO数据库检索筛选得到6套胃癌表达数据，利用生物学信息分析工具对数据进行重新加工分析，筛选出ADAMTS-2基因，进一步进行了分子生物学验证，RT-PCR结果显示，ADAMTS-2基因在胃癌组织中高表达，干扰实验表明，ADAMTS-2-siRNA1能有效降低ADAMTS-2基因的表达。本发明提供了一个新的胃癌诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, A61P35/00, A61K31/713, G01N33/573
【公开号】CN105420366
【申请号】CN201510955009
【发明人】张军利, 漆楠楠, 张勇, 程岳雷
【申请人】张军利, 漆楠楠, 张勇, 程岳雷
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月17日