一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及一种颅内动脉瘤诊治靶点及其应用，更具体的 涉及HAPLN1基因及其表达产物在诊治颅内动脉瘤中的应用。
【背景技术】
[0002]卢页内动脉瘤（intracranialaneurysm，IA)的形成病因和发病机制比较复杂，对IA 的病因和形成机制的研究一直是国内外脑血管疾病研究的重点和热点领域。通常认为IA的 形成、发展和破裂是由遗传、吸烟、年龄、环境、动脉粥样硬化、高血压和高血脂以及血流动 力学改变等多重因素造成的。随着对其研究的不断深入，人们己经逐渐认识到血流动力学 因素在IA的发生、发展和破裂过程中起着非常重要的作用。IA通常多发生在willis动脉环 以及颅内动脉血管分叉处或血管弯曲部位，血液流经此处时形成冲击流等复杂流型使血管 内皮细胞及其连接受损，炎症细胞和炎性物质等更易进入内皮下，引起的血管壁炎症和血 管壁重构失调，研究显示持续的血流动力学变化会导致血管的病理重构，包括内弹力层的 降解、平滑肌细胞和内皮细胞的缺失、细胞增殖减少等。血流动力学因素改变所导致的血管 内皮损伤以及接下来出现的血管壁炎性细胞浸润、蛋白酶降解所致的血管壁病理性重构被 认为是IA形成过程中的主要病理生理环节。无论是通过观察人的颅内动脉瘤壁分子病理学 的研究还是从对IA形成过程中的实验研究均证明了血管内皮损伤是IA形成过程中的基本 环节。但具体哪些基因参与其中仍有待研究。
[0003]发明人对5例颅内动脉瘤病例组和3例对照组组织样本进行高通量测序，结合生物 信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出高表达的候选基因HAPLN1，已 有研究表明HAPLN1和假性软骨发育不全有关，但并没有研究揭示其与颅内动脉瘤的关系， 发明人进行了分子验证，证实了HAPLN1在颅内动脉瘤组中高表达。本发明提供了新的颅内 动脉瘤的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种颅内动脉瘤诊断制剂，所述颅内动脉瘤诊断制剂检测 HAPLN1基因和/或HAPLN1基因的表达产物。
[0005]进一步，所述颅内动脉瘤诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法 检测颅内动脉瘤组织中HAPLN1基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对 特异性扩增HAPLN1基因的引物;所述的基因芯片中包括与HAPLN1基因的核酸序列杂交的探 针，更优选的，焚光定量PCR试剂盒内含有特异性检测HAPLN1基因的上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQIDN0.9,下游引物序列为SEQIDN0.10。
[0006] 进一步，直接检测外周血和/或组织中HAPLN1基因和/或基因的表达产物。
[0007]进一步，所述的颅内动脉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测颅内动脉瘤外周血和/ 或组织中HAPLN1基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。
[0008] 进一步，所述检测HAPLN1表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂 盒中的抗体可采用市售的HAPLN1单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被HAPLN1单克 隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应 终止液等。
[0009] 进一步，所述检测HAPLN1蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的HAPLN1单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 HAPLN1单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0010] 本发明的目的在于提供上述颅内动脉瘤诊断制剂在制备颅内动脉瘤诊断工具中 的应用。
[0011] 本发明的目的在于提供一种治疗颅内动脉瘤的制剂，所述制剂中含有抑制HAPLN1 基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
[0012]进一步，所述治疗颅内动脉瘤的制剂中含有激活HAPLN1的抑制基因、激活抑制HAPLN1表达的蛋白、导入抑制HAPLN1转录或表达的siRNA、激活促进HAPLNlmRNA降解的 microRNA、导入促进HAPLN1蛋白降解的分子、抑制促进HAPLN1表达的因子及蛋白的表达。
[0013] 优选的，所述治疗颅内动脉瘤的制剂含有下列中的一组或几组siRNA:SEQID N0·1和SEQIDN0·2、SEQIDN0·3和SEQIDN0·4、SEQIDN0·5和SEQIDN0·6。更优选的， 所述治疗颅内动脉瘤的制剂含有siRNA序列为SEQIDN0.1和SEQIDN0.2。
[0014]本发明的目的在于提供上述治疗颅内动脉瘤的制剂在制备颅内动脉瘤治疗药物 或试剂中的应用。
[0015]本发明的目的在于提供上述治疗颅内动脉瘤的制剂在制备增强EPCs活性制剂中 的应用。
[0016]为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因HAPLN1基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了HAPLN1基因与颅内动脉瘤的关系： HAPLN1基因在外周血中高表达，与颅内动脉瘤具有很好的相关性，可用于制备颅内动脉瘤 辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0017]本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种:通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA 干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因 编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
[0018] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计 完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[0019] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0020] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0021] 本发明的目的在于提供一种检测颅内动脉瘤的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测 基因HAPLN1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDN0.9,下游引物序 列为SEQIDN0.10。
[0022] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0023] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。所述内参为GAPDH。
[0024]所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0025] 本发明目的是提供了一种颅内动脉瘤蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 HAPLN1蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0026] 本发明目的是提供了一种检测颅内动脉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与 HAPLN1基因的核酸序列杂交的探针。
[0027]本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖 (lactose)、右旋糖(dextrose)、鹿糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀 粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯 P比略烧酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素（cellulose)、水、糖衆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methy1hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidmagnesium)及矿物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0028] 本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜 味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于 雷明登氏药学全书。
[0029]本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通 过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮 给药等方式进行给药。
[0030] 本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、食物