MicroRNA-29b作为药物靶点在关节软骨修复中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于软骨组织工程技术领域，具体涉及Micr〇RNA-29b作为药物靶点在关 节软骨修复中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨关节表面关节软骨受损可由创伤、骨关节炎、肿瘤等多种病因导致，常呈现进行 性的损伤，严重影响患者的生活质量。由于关节软骨缺乏自身修复能力，如何实现关节软骨 缺损的功能性修复是医学领域的一大难题。组织工程学技术结合细胞生物学和生物材料学 对受损组织进行生理性修复，为关节软骨缺损修复提供了一种理想的修复方法。其中，选择 和优化适合的种子细胞是本领域中的重要命题。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)由于其自身优势，被学术界认为是在软骨组织工程中极具应用前景的种子细胞。然 而，在构建组织工程软骨的研究中，MSCs来源的软骨细胞难以维持软骨细胞稳态，部分种子 细胞呈现软骨细胞肥大化表型，提前进入终末软骨细胞阶段，即发生肥大化，成为组织工程 软骨移植后继发细胞凋亡、血管侵入、基质钙化和异位骨化的启动因素，其势必最终影响到 受损关节软骨的修复和功能重建。因此，如何抑制MSCs成软骨分化后的肥大化进程，稳定 MSCs来源的软骨细胞表型，已成为进一步推进MSCs用于关节软骨修复中亟待解决的重要 问题。
[0003] 已有研究显示在MSCs成软骨分化过程中，除了分泌软骨组织特异性基质，还逐 步出现软骨细胞肥大化相关基因表达，包括X型胶原、碱性磷酸酶（ALP)、基质金属蛋白 酶-13(MMP-13)、血管内皮生长因子（VEGF)和甲状旁腺素相关蛋白等。这些基因的表达提 示MSCs向软骨分化过程中可能已经进入了软骨细胞肥大化进程，这是骨骼发育过程中软 骨内骨化的一个典型阶段。这使得体外构建的组织工程软骨在体内难以建立稳定的透明软 骨结构，将会过早启动软骨内成骨，最终导致关节软骨缺损修复失败。
[0004] 正常胚胎发育中，软骨内成骨需要经历以下5个阶段：间质细胞的聚集、增殖，成 软骨细胞分化，成熟的软骨细胞逐渐肥大化，深层基质部分钙化、血管侵入，骨细胞和骨基 质的生成和骨组织的最终替代。由此可见，成熟的软骨细胞肥大化是软骨内骨化的一个必 须环节。干预该环节可望达到延迟软骨内骨化，同时保证MSCs向软骨细胞分化的目的。然 而，现有技术还未有从抑制MSCs来源软骨细胞肥大化的角度来修复缺损的关节软骨的相 关报道。
[0005] 近年来，microRNA作为一类新的基因表达调控分子家族而受到广泛的关注，已有 研究发现它们可作为重要的药物作用靶点和潜在的核酸药物应用于疾病的治疗。另外，大 量的研究证实miRNAs在调控干细胞分化进程中发挥了至关重要的作用，是维持干细胞分 化特性及干细胞定向分化的时空调节的关键因子。本发明前期通过研究发现在MSCs来源 软骨细胞肥大化阶段，microRNA-29b逐渐上调，而HDAC4以及Sox9逐渐下调，也就是说， micr〇RNA-29b是调控MSCs成软骨分化后发生肥大化改变的关键miRNA，作用机制是通过调 节其靶基因 HDAC4继而调节Sox9-Runx2平衡发挥效应。基于此研究结论，在关节软骨修复 中，将microRNA-29b作为药物靶点是可行的。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供MicroRNA_29b作为药物靶点在关节软骨修复 中的应用。本发明采取的技术方案如下：
[0007] l、MicroRNA-29b抑制剂在制备软骨修复药物中的应用。
[0008] 优选的，所述抑制剂为病毒载体、质粒、肽核酸、锁核酸或2-Ome修饰的单链核苷 酸。
[0009] 优选的，所述MicroRNA-29b抑制剂包含与microRNA-29b互补的核酸序列或互补 核酸序列的截短片段。
[0010] 优选的，所述抑制剂包含如SEQ ID NO. 27所示的序列。
[0011] 优选的，所述MicroRNA-29b抑制剂为pGLVU6/GFP慢病毒载体，所述pGLVU6/GFP 慢病毒载体包含如SEQ ID NO. 27所示的序列。
[0012] 2、Micr〇RNA_29b抑制剂在制备抑制间充质干细胞来源软骨细胞肥大化的试剂中 的应用。
[0013] 优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明通过利用microRNA_29b抑制剂抑制 micr〇RNA-29b的表达，进而上调HDAC4以及Sox9的表达，同时抑制软骨细胞肥大化相关 基因 Col X和MMP-13的表达，从而达到抑制MSCs来源软骨细胞肥大化的目的；另外，由于 micr〇RNA-29b表达受到抑制，导致糖胺多糖分泌增多，进一步促进了软骨细胞表型的保持 和稳定；蛋白聚糖的分泌增多则利于异位软骨的形成；上述因素综合作用最终达到受损关 节软骨修复的目的。本发明为优化软骨组织工程的种子细胞提供了新方法，同时也为软骨 细胞肥大化所导致的软骨退行性病变提供了新思路。另外，针对目前在组织工程软骨构建 中由于种子细胞，尤其是骨髓间充质干细胞来源分化的软骨细胞会肥大化，从而引起软骨 修复区域纤维化而不是透明软骨修复的难题，本发明采用micr 〇RNA-29b抑制剂抑制间充 质干细胞肥大化分化，稳定MSCs来源的软骨细胞表型，防止组织工程软骨纤维化和异位骨 化，从而进一步实现组织工程软骨修复，为组织工程软骨构建、软骨支架材料设计及软骨修 复提供了新方法。
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0016] 图 lmicroRNA_29b、Sox9、Runx2 及 HDAC4 的相互关系不意图；其中，microRNA_29b 抑制其靶基因 HDAC4,而HDAC4抑制Runx2降解，从而调节Sox9-Runx2平衡。
[0017] 图2为小鼠骨髓间充质干细胞来源软骨细胞肥大化诱导14、21和28天，HDAC4、 Sox9、Col II、Runx2及Col X的相对表达量结果，由图可知，经过肥大化诱导后，肥大组细 胞HDAC4、Sox9及Col II的表达量显著低于对照组，而Runx2和Col X的表达量则显著高 于对照组。
[0018] 图3为小鼠骨髓间充质干细胞来源软骨细胞肥大化诱导过程中microRNA-29b的 相对表达量与时间关系图，由图可知，随着诱导时间延长，肥大组细胞microRNA-29b的表 达量逐渐增加。
[0019] 图4为转染microRNA-29b inhibitor后Col X和MMP-13基因在不同转染时间的 相对表达量结果图，与对照组相比，转染micr〇RNA-29b抑制剂后细胞肥大化相关基因 Col X和MMP-13的表达明显受到抑制。
[0020] 图5为转染microRNA-29b inhibitor后X型胶原（Col X)免疫组化染色结果 图，该结果在0LYMPUS-IX71显微镜下观察获得，放大倍数为40X。由染色结果可知，转染 microRNA-29b inhibitor后X型胶原表达量较对照组低，尤其转染21天和28天结果差异 更显著。
[0021] 图6为转染micr〇RNA-29b inhibitor后细胞糖胺多糖分泌量结果图，该结果在 0LYMPUS-IX71显微镜下观察获得，放大倍数为40X。甲苯胺蓝染色结果显示，对照组细胞 在转染14天时糖胺多糖分泌量最多，且随细胞肥大化，其分泌量呈递减趋势，28天时分泌 量最少；与对照组相比，转染microRNA-29b inhibitor组的细胞糖胺多糖分泌量较多，并 且在14和21天时尤为显著。
[0022] 图7为microRNA-29b抑制剂对异位软骨形成的影响结果图，该结果在 0LYMPUS-IX71显微镜下观察获得，放大倍数为40X。由图可以看出，经过番红0染色可观 察到microRNA-29b抑制组细胞周围是分泌旺盛的蛋白聚糖。
[0023] 图8为局部注射使用micr〇RNA-29b抑制剂12周后，兔股骨下端髁间窝滑车区 域的全层软骨缺损修复结果图，该结果在0LYMPUS-IX71显微镜下观察获得，放大倍数为 40X。经HE染色后结果显示使用microRNA-29b抑制剂后，软骨缺损得到了良好的修复。
【具体实施方式】
[0024] 本发明所述的"microRNA-2%抑制剂"包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂及阻断剂 等一切能够下调micr 〇RNA-29b表达水平、降低其活性和稳定性、减少其有效作用时间的 物质，它们可以是化合物和化学小分子，也可以是生物分子；所述的生物分子可以是抑制 micr〇RNA-29b表达的病毒产品，也可以是核酸水平（包括DNA和RNA)的分子，例如，肽核酸 (PNA)、锁核酸（LNA)，2-〇me修饰的单链核苷酸等。
[0025] 作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂可选自化学合成的miRNA抑制剂，以 表达质粒为载体的抑制miRNA的病毒和非病毒产品或与micr 〇RNA-29b互补的核酸序列或 序列片段。
[0026] 更佳地，所述的抑制剂是 micr