一种以cyp2e1为靶点的药物筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法。
【背景技术】
[0002]细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)是一类能够与重金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。CYP450于1995年从哺乳动物肝脏的微粒体中发现的，随后在包括昆虫、细菌到高等动物均有发现。CYP450参与催化许多生物过程并引起了专家和学者的广泛关注。
[0003]CYP2E1在许多疾病和生理病理状态下发挥重要作用，并且能够影响致癌作用和药物的疗效。CYP2E1能够催化外源性物质的生物转化，包括药物及毒性物质，如对乙酰氨基酚，挥发性麻醉药(安氟醚，异氟烷，三氟溴氯乙烷)，乙醇以及工业溶剂和化学物质(前致癌物质)。另外，CYP2E1也参与内源性物质的生物转化，如酮体，甘油和不同的脂肪酸。然而，CYP2E1同样能够代谢药物和有毒物质产生有害的活性代谢产物。例如，CYP2E1将对乙酰氨基酚代谢为N-乙酰基对苯醌亚胺，从而诱导氧化应激，线粒体功能丧失和细胞死亡。不仅如此，CYP2E1产生活性氧(ROS)，可以破坏细胞和线粒体，包括线粒体DNA和细胞色素C氧化酶在内的组分。CYP2E1的重要特征之一是可以被不同的小分子有机化合物所诱导，如酒精，吡唑，丙酮或异烟肼等。事实上，酒精诱导CYP2E1是通过抑制其自身降解增强CYP2E1蛋白稳定性及激活CYP2E1转录基因增加其蛋白浓度。因此，在酒精中毒时，肝脏中CYP2E1的含量会显著升高。
[0004]目前研宄认为，在不同的生理病理状态下均能够提高CYP2E1的mRNA或蛋白的表达，包括肥胖，禁食，II型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。通过提高CYP2E1的表达从而导致肥胖，糖尿病或非酒精性脂肪肝病的机制目前仍有争议。在这些病人中，CYP2E1的诱导能够导致肝脏的生酮作用。近期报道称，肝CYP2E1的诱导可以证实与系统性胰岛素抵抗，肝胰岛素信号消减和肝脂肪堆积提高紧密相关。除升高的酮体和胰岛素抵抗，其他因素如肝中脂肪过量堆积或脂肪因子(脂联素，瘦素，等)的分泌也可能是引起肥胖患者CYP2E1表达/活性升高的重要原因。CYP2E1在健康人群和肥胖/糖尿病人中均可产生ROS和活性代谢产物，从而使机体对药物和有毒物质更加敏感。因为线粒体内CYP2E1可以代谢产生大量的有毒物质，从而导致线粒体损伤和功能障碍，最终诱导细胞凋亡产生肝硬化和细胞凋亡。因此，CYP2E1在疾病的发生和药物代谢中发挥重要作用。
[0005]目前，针对CYP2E1的药物筛选局限于其抑制剂的筛选。提取肝脏微粒体，将药物加入到含底物(4-硝基苯酚)，NADPH生成系统，6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的磷酸钾缓冲液中，检测CYP2E1的活性，从而筛选出CYP2E1的抑制剂。但此方法存在局限性:I)肝脏微粒体的提取条件要求苛刻:需要超高速低温离心机；2)提取的微粒体蛋白含量少且易失活:超高速离心得到微粒体蛋白会紧密的形成一团，在微粒体蛋白吹打溶解的过程中容易产生气泡从而氧化失活；3)对CYP2E1诱导剂的筛选无效:微粒体蛋白提取后质量不会增加，诱导剂不能增加CYP2E1的总量；4)药物干扰:检测CYP2E1活性是采用分光光度法在A535nm处检测Img蛋白在15min内CYP2E1代谢产物(4-硝基儿茶酚)的生成含量计算，某些药物在A535nm也有吸收峰会对CYP2E1活性的检测形成干扰。
[0006]鉴于微粒体以上不足，线粒体成为本方法的靶器官。CYP2E1定位于线粒体的证据，于1997年，Avadhani课题组用抗体蛋白直接识别线粒体内CYP2E1第一次发现CYP2E1在线粒体内的存在，随后电镜实验证明免疫胶体金标记CYP2E1同样存在于线粒体内膜上。随后，从大鼠肝线粒体纯化出线粒体蛋白，鉴定全长的CYP2E1，并研宄其分子性质和酶活性。酒精和吡唑是CYP2E1的诱导剂，在吡唑处理的大鼠的肝脏中，线粒体CYP2E1占肝组织总CYP2E1的40%，并且线粒体中CYP2E1的磷酸化高于内质网线粒体。AMLD1-TOF分析法和氨基端氨基酸测序法证明大鼠肝线粒体CYP2E1与微粒体CYP2E1有共同的氨基酸序列。线粒体和微粒体内CYP2E1的结构大部分是相同的，无明显差异。在人和大鼠的脑线粒体中也发现CYP2E1的存在。有趣的是，CYP2E1依赖的单氧化酶N-nitrosodim-ethylamine-N-demethylase在脑线粒体中的活性是微粒体中活性的两倍。因此，与微粒体CYP2E1相比，线粒体CYP2E1结构无差异，但活性CYP2E1的含量却明显高于内质网含量。
[0007]目前，正对CYP2E1的药物筛选模型多以药物与微粒体共孵育从而检测CYP2E1的活性，筛选出CYP2E1的抑制剂。利用这种方法只能筛选CYP2E1的抑制剂，而不能对其诱导剂进行有效的筛选，具有局限性；微粒体的提取需要超高速低温离心机，且提取量相对较少，条件相对比较苛刻。本研宄建立有活性的肝匀浆孵育体系能够有效的筛选鉴于CYP2E1在不同物种的不同组织器官分布的广泛性、对机体生理病理调控的重要性及对药物代谢催化的高效性，有必要针对CYP2E1建立一种简单有效的药物筛选方法。
【发明内容】
[0008]发明目的:本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种简单有效的针对CYP2E1为靶点的药物筛选方法，以便筛选出CYP2E1的诱导剂和抑制剂，从而为药物的体内及药物间相互作用的预测提供依据。
[0009]技术方案:一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法，包括如下步骤:
[0010]SI获取动物的新鲜组织并剪碎，然后加入缓冲溶液进行至少一次的匀浆，直至浆料为粉红色均一的组织混悬液为止，得到生物活性匀浆孵育体系；
[0011]S2将所需检测的药物进行稀释成10,?10 ^mg/mL后，再按照需检测的药物:生物活性匀浆孵育体系=I: 10的体积比将需检测的药物加入到步骤SI所得的生物活性匀浆孵育体系中进行孵育；
[0012]S3对S2所得的生物活性均匀浆孵育体系进行二次匀浆，待所述生物活性均匀浆孵育体系与药物作用结合后，通过提取生物活性均匀浆孵育体系的线粒体方式提取所述生物活性均匀浆孵育体系的CYP2E1 ；
[0013]S4检测步骤S3的线粒体中CYP2E1的表达和活性。
[0014]需要说明的是，步骤SI中，选用的缓冲溶液为TMS buffer或线粒体提取液，所述线粒体提取液由蔗糖、EDTAJP Tris-HCl(pH 7.4)等按比例配制而成的。
[0015]需要说明的是，步骤SI中，剪碎后的动物新鲜组织与缓冲溶液液的稀释质量比为
1:10ο
[0016]需要说明的是，步骤SI中，匀浆速度为1.0?2.5rpm。
[0017]需要说明的是，步骤SI中，动物包括但不限于家禽、大鼠和小鼠中的一种，而动物新鲜组织则包括但不限于肝脏、脾脏、肾、脑、心脏和肠道中的一种。
[0018]需要说明的是，步骤SI中，每次匀浆均在(TC的冰水混合物中进行。以保证肝匀浆孵育体系的生物活性。
[0019]需要说明的是，步骤S2中孵育条件为:在0°C的冰水混合物中孵育15?30分钟。
[0020]需要说明的是，步骤S4中，具体采用Western blot的方法检测CYP2E1的表达，用底物反应法检测CYP2E1的活性。如此有助于从量和活性的双重角度评价药物对CYP2E1的影响。
[0021]有益效果:本发明公开了一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法具有以下有益效果:
[0022]1、所提供的方法不再局限于筛选CYP2E1抑制剂，而是能够筛选CYP2E1抑制剂和诱导剂；
[0023]2、方法简单，比现有的方法更加容易操作和省时；
[0024]3、本发明选择提取线粒体以进行CYP2E1的提取，与传统的提取微粒体相比能更高效地获得活性CYP2E1 ；
[0025]4、避免药物干扰，且更接近生理状态，更能反映体内实际效果；
[0026]6、节省实验动物；
[0027]7、与体内实验相比，缩短实验周期；
[0028]8、采用Western blot的方法检测CYP2E1和药物作用后的表达，用底物反应法检测CYP2E1的活性，同时反映了 CYP2E1表达和活性的变化。
【具体实施方式】
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[0029]下面对本发明的【具体实施方式】详细说明。
[0030]具体实施例1
[0031 ] 一种以CYP2E1为靶点的药物筛选方法，包括如下步骤:
[0032]SI获取动物的新鲜组织并剪碎，然后加入缓冲溶液进行至少一次的匀浆，直至浆料为粉红色均一的组织混悬液为止，得到生物活性匀浆孵育体系；
[0033]S2将所需检测的药物进行稀释成10_1(lmg/mL后，再按照需检测的药物:生物活性匀浆孵育体系=I: 10的体积比将需检测的药物加入到步骤SI所得的生物活性匀浆孵育体系中进行孵育；
[0034]S3对S2所得的生物活性均匀浆孵育体系进行二次匀浆，待生物活性均匀浆孵育体系与药物作用结合后，通过提取生物活性均匀浆孵育体系的线粒体方式提取生物活性均匀浆孵育体系的CYP2E1 ；
[0035]S4检测步骤S3的线粒体中CYP2E1的表达和活性。
[0036]本实施例中，步骤SI中，选用的缓冲溶液为TMS buffer ο
[0037]本实施例中，步骤SI中，剪碎后的动物新鲜组织与缓冲溶液液的稀释质量比为
1:10ο
[0038]本实施例中，步骤SI中，匀浆速度为l.0rpm。
[0039]本实施例中，步骤SI中，动物为家禽，动物新鲜组织则为肝脏。
[0040]本实施例中，步骤SI中，每次匀浆均在0°C的冰水混合物中进行。以保证肝匀浆孵育体系的生物活性。
[0041]本实施例中，步骤S2中孵育条件为:在0°C的冰水混合物中孵育15?30分钟。
[0042]本实施例中，步骤S4中，具体采用Western blot的方法检测CYP2E1的表达，用底物反应法检测CYP2