tcacgaatttgcgtgtcat-3，（SEQ ID NO. 14);
[0060] microRNA-29b 基因上游引物：5，-ggctgggtcttccgattgaatctcc-3'（SEQ ID NO. 15)；
[0061] microRNA-29b 基因下游引物：5' -tccacccttggctgtgctgca-3'（SEQ ID NO. 16);
[0062] 使用All-in-〇ne?qPCR Mix试剂盒配制microRNA-29b cDNA产物荧光实时定量 ?〇?反应体系：体系包括2父六11-111-0116 9?〇?1^叉1(^1^24]\1的？〇?特异引物？24 1^ 2μΜ特异引物 R 2yL，cDNA 2yL，50XR0X Reference DyeiV 0.4yL，ddH20 3.6yL;反 应条件：95°C，IOmin ;95°C，10s，40 次循环；60°C，20s ;72°C，30s ;78°C，20s。
[0063] 结果：体外模拟间充质干细胞软骨内成骨过程，通过离心使间充质干细胞高度凝 集以模拟正常生理过程，通过在培养基中添加 TGF-β 3诱导MSCs向软骨分化，当分化诱导 14天后去除TGF-β 3,添加甲状腺激素 Τ3,促进软骨细胞向肥大化软骨细胞分化。当除去 TGFβ 3,降低地塞米松的浓度，添加 Τ3体外诱导软骨细胞肥大化时，结果显示Sox9、C〇l II 的表达量显著低于对照组，Runx2、Col X的表达量显著高于对照组（图2)。并且该过程中， HDAC4也呈现降低表达。
[0064] 在间充质来源肥大化软骨细胞诱导过程中micr〇RNA-29b的表达逐渐升高，而 HDAC4、Sox9的表达量逐渐降低，显示microRNA-29b的表达量增加是影响细胞肥大化进程 的重要因素，且实验组与对照组比microRNA-29b表达差异显著（图3)，HDAC4、Sox9的表达 与microRNA-29b呈负相关（具体关系见图1)。由此可知microRNA-29b的表达增加促进了 软骨细胞向肥大化软骨细胞的分化，提示可通过降低microRNA-29b的表达来抑制软骨细 胞的肥大化进程，阻断MSCs成软骨分化进入后期软骨内骨化进程稳定软骨表型，从而实现 组织工程软骨的稳定功能性修复。
[0065] 实施例3转染micr〇RNA-29b抑制剂后可明显抑制肥大化软骨细胞相关基因表达
[0066] 转染实验：采用Lipofectamin? 2000试剂盒，取正常培养的间充质干细胞成细胞 微团培养，前14天使用培养基B (含TGF- β 3完全软骨诱导培养基）进行软骨诱导培养，从 第15天开始更换为培养基C (肥大化软骨诱导完全培养基）继续进行培养，在培养第14天、 第21天、第28天分别取材进行后续实验检测。实验分为对照组和实验组两组，实验组转染 microRNA-29b inhibitor，对照组转染microRNA-29b inhibitor negative control (经过 生物信息学分析表明其与人、小鼠、大鼠的基因组，以及miRBase数据库中所有miRNA具有 最小的同源性，适用于人、小鼠、大鼠的miRNA实验阴性对照），培养方法同实施例1。
[0067] 转染试剂制备：
[0068] A 液：在 200 μ L 无 RNA 酶的 EP 管中加入 48 μ L Opti-MEM 和 2 μ L Lipofectamin? 2000,轻柔混匀后室温孵育5min ;
[0069] B液：在另一 EP管中加入48μ L Opti-MEM和2μ L miRNA，轻轻混匀后室温孵育 5min ；
[0070] 将A液和B液混匀并室温孵育20min，以促使转染复合物的形成；
[0071] 去除原培养团中的旧培养基,将A液和B液的混合液加入到实验组细胞团中，并补 充400 μ L Opti-MEM培养基，24小时后替换为培养基B (含TGF- β 3完全软骨诱导培养基）， 继续培养14天；从第15天开始更换为培养基C (肥大化软骨诱导完全培养基）。从第10天 开始进行第一次转染，以后每5天转染一次。
[0072] 提取样品总RNA，实时定量PCR进行肥大化软骨细胞相关基因 mRNA表达检测。II 型胶原（Col II )、X 型胶原（Col X)、Sox9、Runx2 引物如 SEQ ID NO. 1 ?SEQ ID NO. 8 所 示，小鼠来源的FGFR-3、PTHrP、Ihh、MMP-13以及内参基因 GAPDH的mRNA序列在NucIeotide 数据库获取，用Primer Premier 5. 0软件设计相应的PCR引物如下：
[0073] FGFR-3 基因上游引物：5，-gaggctacaaggttcgctatg-3，（SEQ ID NO. IT7);
[0074] FGFR-3 基因下游引物：5，-gatgctcccatactcattctcc-3，（SEQ ID NO. 18);
[0075] PTHrP 基因上游引物：5，-gcagatccagatgcactatgag-3'（SEQ ID NO. I9);
[0076] PTHrP 基因下游引物：5，-cggctccaagacttcctaatc-3'（SEQ ID NO. 20);
[0077] Ihh 基因上游引物：5，-ttcaaggacgaggagaacacg-3，（SEQ ID NO. 2I);
[0078] Ihh 基因下游引物：5，-ggtcacccgcagtttcaca-3，（SEQ ID NO. 22);
[0079] MMP-I3 基因上游引物：5，-gatgatgaaacctggacaagc-3'（SEQ ID NO. 23);
[0080] MMP-13 基因下游引物：5，-ccagtgtaggtatagatgggaaac-3，（SEQ ID NO. 24);
[0081] GAPDH 基因上游引物：5，-tacattgccttccgtgttcctacc-3，（SEQ ID NO. 25);
[0082] GAPDH 基因下游引物：5，-agtttgacctcagatgcctgcttc-3，（SEQ ID NO. 26);
[0083] 结果：间充质干细胞诱导成软骨分化过程中分别转染microRNA-29b inhibitor 以及对照microRNA_29b inhibitor negative control，继而用培养基C培养细胞，第14 天、第21天和第28天分别收集细胞，荧光实时定量PCR检测成肥大化软骨分化相关基因 Col X及MMP-13的表达，结果如图4所示，转染micr〇RNA-29b抑制剂后肥大化相关基因 Col X及MMP-13的表达与对照组相比明显受到抑制（P〈0. 05)。
[0084] 利用小鼠骨髓间充质干细胞成软骨肥大化诱导模型，进行干预实验检测 microRNA-29b抑制剂对肥大化的作用效应，实验结果显示，抑制microRNA-29b的表达可抑 制肥大化软骨细胞相关基因 Col X、Ihh、PTHrP、FGFR-3、MMP-13及Runx2表达，并可促进软 骨细胞特异性标志蛋白Col II和软骨特异性转录因子Sox9的表达。Col II蛋白作为软骨 细胞外基质的主要组成成分，对关节软骨的抵抗外界压力以及伸张能力起着关键作用。在 软骨细胞进入肥大化阶段，软骨细胞去分化丧失分泌其特异性分子标志物的能力，Col II蛋 白表达量降低。在本实验中，实验组转染micr〇RNA-29b抑制剂后Col II蛋白的表达量在诱 导21d和28d时明显高于对照组。在诱导第28d实验组Col X蛋白的表达量明显低于对照 组。随着软骨细胞肥大化进程的进行，细胞逐渐呈现纤维软骨表型，纤维软骨细胞的特异性 标志蛋白Col X蛋白的表达量逐渐增加 ，Col X蛋白作为肥大化软骨细胞外基质的主要成 分为随后发生的基质矿化提供了主要骨架结构。结果证实，抑制microRNA-2%的表达可抑 制肥大化特异性蛋白mRNA的表达与此同时可促进软骨细胞特异性蛋白mRNA的表达。
[0085] 实施例4转染micr〇RNA-29b抑制剂后可明显抑制肥大化软骨细胞微团X型胶原 的表达
[0086] 免疫组化染色实验：
[0087] (1)制片：取转染 microRNA-2% inhibitorl4、2l、28 天的细胞团，0· OlM 的 PBS 清 洗一次后用4%多聚甲醛固定30min，再用PBS清洗3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规 石蜡包埋，最后切片，切片厚度5 μ m。石蜡切片放入37°C烘箱中过夜，常规脱蜡至水。
[0088] (2)免疫组化染色：使用免疫组化染色试剂盒进行X型胶原免疫组化染色，首先滴 加 3%的H2O2均匀覆盖组织切片，室温孵育5min以消除内源性过氧化物酶的影响，然后蒸 馏水冲洗切片，PBS清洗3次，每次5min ;正常山羊血清工作液进行抗原修复，滴加山羊血 清均匀覆盖切片，室温孵育20min后直接倾去封闭液后无需清洗；滴加兔抗小鼠 X型胶原一 抗（抗体与稀释液按1:200稀