一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物。
【背景技术】
[0002]病原菌严重危害人类身体健康，需要采用有效措施进行防治。虽然抗生素能够有效杀死细菌，但由于抗生素的滥用，细菌产生了耐药性。具有耐药性的细菌使原本有效的抗生素治疗效果降低或丧失，导致感染难以控制。因此，采用新的方法控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
[0003]增强细菌对抗菌药物的敏感性是目前控制多重耐药菌的一个热点研究领域。这一抗菌途径需要建立在克服耐药机制的基础上。如针对细菌产生的bete-内酰胺酶，可以研究合成酶抑制剂，以便将酶抑制剂和抗菌药物联合使用，达到在克服细菌耐药的同时发挥抗菌药物杀菌作用的目的。目前，临床可供使用的有bete-内酰胺酶抑制剂和青霉素(或头孢菌素)复方应用。进一步研究促进细菌对抗生素敏感性的药物，与抗生素一起制备成复方制剂，对控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
[0004]丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一。它的分子式是C3H7O2N，有α-丙氨酸和丙氨酸两种同分异构体。现有技术中已公开丙氨酸可以预防肾结石、协助葡萄糖的代谢，有助缓和低血糖，改善身体能量。而关于丙氨酸能否提高抗生素和宿主清除病原菌的研究并未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供丙氨酸(Alanine，Ala)作为一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物质，达到控制细菌特别是耐药菌感染目的的技术方法。
[0006]本发明发现添加丙氨酸后，卡那霉素对迟缓爱德华耐药菌的杀菌作用明显提高，呈现卡那霉素浓度效应、丙氨酸浓度依赖性和作用时间相关性。这些结果说明，丙氨酸可以增强迟缓爱德华耐药菌对卡那霉素的敏感性。作为对照组的非耐药菌也对抗生素的敏感性也得到提闻。
[0007]本发明通过添加丙氨酸后，提高了迟缓爱德华菌多重耐药菌，氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株对卡那霉素敏感性，说明这种作用可以适用于不同耐药机制的耐药菌。
[0008]本发明通过添加丙氨酸后，不同程度地提高了迟缓爱德华菌多重耐药菌对庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素的敏感性，说明这种作用可以适用于不同抗生素。
[0009]本发明通过添加丙氨酸后，不同程度地提高了迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌对庆大霉素的敏感性，说明这种作用可以适用于不同病原菌。
[0010]本发明通过添加葡萄糖后，迟缓爱德华耐药菌在用卡那霉素处理时生存率明显下降，说明葡萄糖可以提高卡那霉素耐药菌对卡那霉素的敏感性。进一步通过丙氨酸和葡萄糖两种物质联用的添加试验，发现这两种添加物质具有明显的协同作用。
[0011]进一步采用小鼠慢性尿道感染模型，于尿道中植入耐药菌生物膜，然后注射卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖进行治疗。结果发现，添加物质的治疗组具有明显的杀菌效果，其中以2种小分子物质与抗生素联用效果最佳。同时对肾脏组织中的细菌含量进行检测，结果发现卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖治疗组细菌数明显下降，其中以2种小分子物质与抗生素联用效果最佳。这些结果说明，卡那霉素与丙氨酸或/和葡萄糖联合可以有效清除动物机体内的耐药菌。
[0012]本发明发现丙氨酸通过提高细菌质子动力势(PMF)，促进抗生素进入胞内，使胞内抗生素含量增加，从而提高细菌对抗生素敏感性
综上所述，在抗生素中添加丙氨酸能够明显提高耐药菌和非耐药菌对抗生素的敏感性，为耐药菌的治疗提供了一种崭新的技术方法。
[0013]由此，发明公开并保护了丙氨酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。其可用于制备抑菌或杀菌的药物，进一步增强细菌或耐药菌对抗生素的敏感性。
[0014]同时，发明公开并保护了一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于将丙氨酸与抗生素联用。
[0015]所述的细菌包括但不限于为迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。因为这些细菌是常见人类和养殖动物致病菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，迟缓爱德华菌、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌。这些细菌可以是耐药菌，也可以是非耐药菌。这些细菌为常见的病原菌，且常见其耐药菌株，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。
[0016]所述的抗生素选自但不限于为卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。因为氨曲南、头孢他啶和头孢唑林钠为内酰胺类抗生素；巴洛沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素、卡那霉素和新霉素为氨基糖苷类抗生素；吉他霉素为氯霉素类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。
[0017]所述的丙氨酸与抗生素的剂量比例按重量计为1:0.0015~300。
[0018]应用上述方法来提高细菌对抗生素的敏感性时，丙氨酸的使用浓度为3mg~30g/次给药。
[0019]通过本发明所公开的内容，还可制备出一种新的抑菌或杀菌剂，该剂含有抗生素和丙氨酸；或者一种提高抗生素对耐药菌抑菌或杀菌作用的制剂，其主要成分为丙氨酸和抗生素。
[0020]尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。尤其是本发明多数验证试验是以迟缓爱德华菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为I)金黄色葡萄球菌为研究耐药机制的模式菌。2)上述细菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，迟缓爱德华菌、副溶血弧菌和肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌。而所有人类和养殖动物病原菌均可以按照该染色进行分类，故上述细菌具有较好的代表性。3)细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，而本发明的对照菌株即为相对非耐药状态，在添加丙氨酸后亦提高了对抗生素的敏感性。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。
[0021]本发明实施例所列举的抗生素为卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。但同样的，这些抗生素也并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为虽然抗生素的品种数以百计，但可以根据其化学结构和抗菌机制可以分类，相似化学结构的具有相同的抗菌机制，因此不需要一一进行验证。目前，临床主要常用抗生素分为:青霉素类抗生素，头孢菌类抗生素，喹诺酮类抗生素，氨基糖苷类抗生素等。氨曲南、头孢他啶和头孢唑林钠为β_内酰胺类抗生素；巴洛沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素、卡那霉素和新霉素为氨基糖苷类抗生素；吉他霉素为氯霉素类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。因此，具有很好的抗生素代表性。本领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到，临床其余多种抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。
[0022]发明同时发现丙氨酸和葡萄糖联用，在提高细菌对抗生素敏感性方面具有明显协同作用。
[0023]优选地，丙氨酸和葡萄糖的重量比为1:0.0001~10000。
[0024]优选地，所述的抗生素选自卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。
【附图说明】
[0025]图1为丙氨酸可提高迟缓爱德华氏耐药菌对卡那霉素的敏感性结果，A、B和C图分别表明此作用具有丙氨酸浓度依赖性、卡那霉素浓度效应和与作用时间相关。
[0026]图2为迟缓爱德华菌的氨苄耐药菌、巴洛沙星耐药菌和四环素耐药菌的MIC测定结果。
[0027]图3为迟缓爱德华氏菌对多种抗生素的MIC测定结果。
[0028]图4为丙氨酸提高迟缓爱德华菌及其耐药菌对卡那霉素的敏感性(A)以及提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性(B)结果。
[0029]图5为丙氨酸提高迟缓爱德华菌对多种抗生素敏感性的结果。
[0030]图6为丙氨酸通过提高细菌PMF (A)使进入胞内抗生素含量增多(B)而提高细菌对抗生素敏感性测定结果。
[0031]图7为丙氨酸和葡萄糖协同作用显著提高耐药菌对卡那霉素的敏感性测定结果。A、B和C图分别表明葡萄糖提高敏感性结果、丙氨酸协同葡萄糖(B)和葡萄糖协同丙氨酸(C)提高敏感性结果。
[0032]图8为丙氨酸和葡萄糖提高小鼠对迟缓爱德华菌的清除结果。A为生物膜上的清除效果，B为小鼠肾脏清除效果。
[0033]
【具体实施方式】
[0034]下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
[0035]实施例1迟缓爱德华菌人工传代耐药菌株的获得和野生耐药菌的确认
1、人工传代迟缓爱德华菌LTB4耐药菌株的