育 30 分钟，用流式细胞仪 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)在488纳米测定红光和绿光的荧光强度，红光强度与绿光强度的比值表示膜电位的强度。PMF值计算公式为Log(10 3/2X红光荧光强度/绿光荧光强度)。PMF测定结果见图6A。从此结果可知，加入物质后，PMF提高约10倍。
[0048]卡那霉素含量测定:将制备的EIB202细菌样本分成3组:加生理盐水组、40 μδ/mL卡那霉素组和40 Pg/mL卡那霉素加40mM丙氨酸组。30°C、200rpm培养6小时后，采用ELISA快速检测试剂盒(北京中检维康科技有限公司)检测细菌内卡那霉素含量。
[0049]I)测定卡那霉素标准品的标准曲线:将卡那霉素标准品稀释成不同浓度梯度，分别加入酶标板的不同孔中；在每一孔中分别加入50yL酶标抗原和50 μ L抗体，加盖、37°C孵育30分钟；倒出孔中的液体，加洗涤液洗涤4次；每孔加入15(^1^显色底物，371:避光孵育10分钟；每孔加入50 μ L反应终止液，混匀后用酶标仪测定450纳米处的OD值，绘出卡那霉素浓度与吸光度的标准曲线。
[0050]2)样品测定:分别离心收集各种处理组细菌，用生理盐水洗3遍后重悬于生理盐水中，调0D_至1.0，取I毫升菌体超声破碎3分钟，离心后取50 μ L上清，按照上述同样方法测定450纳米处的OD值。再根据标准曲线计算每个样品的卡那霉素含量，结果见图6Β。从此结果可以看出，在仅加入卡那霉素时，进入细菌内抗生素仅40纳克/毫升，而当加入丙氨酸后，进入细菌内的抗生素含量显著提高4倍。
[0051]实施例6丙氨酸和葡萄糖协同作用可显著提高耐药菌对卡那霉素的敏感性
1、葡萄糖可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性:在制备好的细菌样品(5mL菌液)中，力口入终浓度分别为4(^g/mL (EIB202)或80(^g/mL (LTB4-R)卡那霉素同时，不加或加入不同浓度的葡萄糖，使其终浓度分别为O、1.25、2.5、5、10和20mM。然后30°C、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，计算不同葡萄糖浓度下的生存率。计算公式为:生存率(％)=(力口入葡萄糖后活菌数/不加葡萄糖活菌数)X 100%，结果见图7A。由图7A可见，与只加入抗生素的对照相比，即使加入最低浓度的葡萄糖，耐药菌存活细菌数明显减少，且随着加入物质浓度提高而杀菌能力增加。这些结果表明，葡萄糖可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性；而且敏感性与葡萄糖浓度相关:葡萄糖浓度越高，耐药菌敏感性越高。在1mM葡萄糖时可分别提高EIB202和LTB4-R对卡那霉素敏感性近400和300倍。
[0052]2、丙氨酸和葡萄糖的协同可显著提高耐药菌对抗生素的敏感性:将制备好的细菌样品分成两组:一组在5mL菌液中加入终浓度为4(^g/mL卡那霉素(EIB202)或80(^g/mL卡那霉素(LTB4-R)和1mM葡萄糖前提下，分别加入丙氨酸，使其终浓度分别为O、10、20、40和80mM ;一组在5mL菌液中加入终浓度为4(^g/mL卡那霉素(EIB202)或80(^g/mL卡那霉素(LTB4-R)和40mM丙氨酸前提下，分别加入葡萄糖，使其终浓度分别为O、2.5、5、10和20mM。然后3(TC、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为:生存率(％)=(加入代谢物后的活菌数/不加代谢物的活菌数)X 100%。丙氨酸协同作用结果见图7B，葡萄糖协同作用结果见图7C。由图7B可知，加入丙氨酸后，与对照只加入葡萄糖相比，耐药菌存活细菌数明显减少，1mM丙氨酸协同葡萄糖作用效果提高近10倍；随着加入丙氨酸浓度增加，其活菌数越来越少。当丙氨酸为40mM时作用效果提高150倍。由图7C可知，加入葡萄糖后，与对照组只加入丙氨酸相比，耐药菌存活细菌数也明显减少，
2.5mM丙氨酸协同葡萄糖作用效果提高50倍；随着加入物质浓度增加，其活菌数也越来越少。当葡萄糖为1mM时作用效果提高500倍。这两个结果充分说明，对提高耐药菌的卡那霉素敏感性来说，丙氨酸和葡萄糖联合使用明显优于单独使用任一物质。
[0053]实施例7丙氨酸可提高小鼠对迟缓爱德华菌的清除
分别挑取EIB202和ATCC15947单克隆置于LB培养基中培养24h，然后按1:100转接至2mL新鲜LB培养基中，并加入经过紫外灭菌3小时的6_ PE-50生物导管，将它们分别置于30°C和37°C培养箱中培养72小时，期间每天更换一半新鲜培养基。将制备的细菌生物膜导管置于1.5 mLEP管中，用生理盐水洗涤5遍后，植入雌性BALB / c小鼠(6周，体重约18~20 g)的尿道中。48小时后，将小鼠随机分为2大组(分别16只)，即无卡那霉素和有卡那霉素组。每个大组又分生理盐水、丙氨酸、葡萄糖、丙氨酸+葡萄糖4个组。每组8只小鼠。每日两次进行腹腔注射。剂量分别为3g kg—1丙氨酸和1.5g kg—1葡萄糖，抗生素的剂量3 mg kg'连续治疗3天。最后一次治疗24小时后,取导管管材于生理盐水中超声悬浮生物膜细菌，梯度稀释并平板计数，计算导管生物膜上的细菌存活率。计算公式为注射物质组活菌数/对照组活菌数X 100%。通过结果分析，发现EIB202菌加入卡那霉素后的生存率为75.82%，只加丙氨酸时为91.05%,同时加卡那霉素降低为3.79% ;只加葡萄糖时为80.19%，同时加卡那霉素降低为5.43% ;只加丙氨酸和葡萄糖时为78.06%，同时加卡那霉素降低为2.99% ;结果见图8A。ATCC15947菌加入卡那霉素后的生存率为89.04%,只加丙氨酸时为87.38%，同时加卡那霉素降低为6.09% ;只加葡萄糖时为91.87%，同时加卡那霉素降低为12.65% ;只加丙氨酸和葡萄糖时为81.79%，同时加卡那霉素降低为4.11% ;结果见图8A。从这些结果可以看出，I)添加抗生素同时添加丙氨酸的试验组其生物膜上的细菌明显减少，对于EIB202，与只添加丙氨酸和抗生素相比，分别减少了 24和20倍；对于ATCC15947，与只添加丙氨酸和抗生素相比，均减少了 14倍；2)在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显提高清除耐药菌的能力，对于EIB202，与只添加葡萄糖相比，减少了 14倍；对于ATCC15947，与只添加葡萄糖相比，减少了 7倍；3)当丙氨酸和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率又可提高分别26倍和19倍。
[0054]同时，取每只小鼠的肾脏加入适量生理盐水充分研磨匀浆，平板计数检测肾脏组织中的细菌含量(活菌数/克)。统计结果见图SB。分析比较后发现，I)添加抗生素同时添加丙氨酸的试验组肾脏的活菌数明显减少，与只添加丙氨酸和抗生素的对照组相比，活菌数分别减少了 2倍。2)在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显清除耐药菌，其效率提高2倍；3)当丙氨酸和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率提高5倍。
[0055]综合以上动物试验结果说明，丙氨酸可提高机体内卡那霉素耐药菌对卡那霉素的敏感性。而且丙氨酸和葡萄糖这两种物质的作用具有协同性，当联合使用时效果更佳。
【主权项】
1.丙氨酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
2.一种抑菌或杀菌的药物，其特征在于，含有抗生素和丙氨酸。
3.一种提高细菌对抗生素敏感性以清除病原菌的方法，其特征在于，将丙氨酸与抗生素联用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细菌为迟缓爱德华菌、副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的细菌为敏感菌、耐药菌。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的丙氨酸与抗生素的剂量比例按重量计为 1:0.0015~300。
7.根据权利要求3或4或6所述的方法，其特征在于，所述的抗生素选自卡那霉素、庆大霉素、新霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢唑林钠、巴洛沙星和吉他霉素。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的丙氨酸的使用量为3mg~30g/次给药。
9.丙氨酸和葡萄糖联用在提高细菌对抗生素敏感性以清除病原菌方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的丙氨酸和葡萄糖的重量比为1:.0.0001?10000。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体公开了一种小分子化合物丙氨酸（Alanine）的新用途。本发明通过研究发现丙氨酸能够增强抗生素杀死病原菌包括耐药菌的作用。因此本发明所提供的小分子代谢物丙氨酸，可作为药物提高抗生素的杀菌功能。
【IPC分类】A61K31-546, A61K31-7048, A61K31-198, A61P31-04, A61K31-427, A61K31-7036, A61K31-4709, A61K31-7004
【公开号】CN104586869
【申请号】CN201410847941
【发明人】彭宣宪, 李惠, 苏玉斌
【申请人】中山大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日