获得:用两倍稀释法检测迟缓爱德华菌LTB4起始株(命名为LTB4-S)对卡那霉素(Kanamycin)的最小抑菌浓度。继而将LTB4-S以15菌落形成单位/毫升的数量在含1/2最小抑菌浓度卡那霉素的培养基中连续培养10代，测定其最小抑菌浓度。如果其最小抑菌浓度/起始最小抑菌浓度> 4，则该菌株对该抗生素表现出耐药性，即为耐药菌株。结果发现，选择出的菌株的最小抑菌浓度为20(^g/mL,是起始株LTB4-S (3.125Pg/mL)的64倍，说明获得了迟缓爱德华菌LTB4的卡那霉素耐药菌株(命名为LTB4-R)。
[0036]2、野生迟缓爱德华菌卡那霉素耐药菌株的确认:将实验室_80°C保存的迟缓爱德华菌EIB202划线于LB平板上，置于30°C恒温培养箱培养24小时；从平板上挑取单菌落，接种于5mL LB培养基中，30°C、200rpm培养至饱和；按1:100 (v/v)的比例接种于5mL的LB液体培养基中，30°C培养至0D_值为0.5，测定最小抑菌浓度。结果发现，EIB202的最小抑菌浓度为12.5 Pg/mL，是LTB4-S (3.125Pg/mL)的4倍，说明EIB202是对卡那霉素具有抗性的野生耐药菌株。
[0037]以下体外试验均采用具有耐药性的人工传代耐药菌(LTB4-R)和野生耐药菌(EIB202)进行。
[0038]3、试验用细菌的培养和样品的制备:分别挑取迟缓爱德华菌LTB4-R和EIB202平板单克隆于10mL LB液体培养基中，30°C、200rpm培养至饱和；收取适量的饱和菌体，8000rpm离心2min。然后用无菌生理盐水洗涤菌体3次；将洗涤后的菌体用I XM9培养基调到OD值为0.2，然后分装5mL菌液于试管中备用。
[0039]实施例2丙氨酸可提高迟缓爱德华耐药菌对卡那霉素的敏感性
1、耐药菌对卡那霉素敏感性随丙氨酸浓度增加而提高:在制备好的5mL菌液中加入终浓度分别为4(^g/mL (EIB202)或80(^g/mL (LTB4-R)卡那霉素的同时，不加或加入不同浓度的丙氨酸，使丙氨酸的终浓度分别为0、5、10、20、40和80 mM ;30°C、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，计算不同代谢物浓度下的生存率。计算公式为:生存率(％)=(加入丙氨酸后活菌数/不加丙氨酸活菌数)X 100%，结果见图1A。由图1A可知，即使加入最低浓度的丙氨酸，与对照只加入抗生素相比，耐药菌存活细菌数明显减少，且随着加入物质浓度提高，其活菌数越少。这些结果说明不同浓度的丙氨酸都可以提高耐药菌对卡那霉素敏感性。在40mM丙氨酸时可提高EIB202对卡那霉素敏感性约120倍，提高LTB4-R对卡那霉素敏感性约60倍。
[0040]2、耐药菌对卡那霉素的敏感性具有浓度依赖性:将制备好的5mL细菌样品，分成加或不加终浓度为40mM丙氨酸2组。这2组分别加入不同浓度的卡那霉素，其中EIB202加入终浓度分别为O、10、20、30、40和50 Pg/mL ；LTB4-R加入终浓度分别为O、200、400、600、800和lOOOPg/mL。然后30°C、200rpm培养6小时，用平板检测其活菌数，然后计算不同抗生素浓度下的生存率。计算公式为:生存率(％)=(加入抗生素后活菌数/不加抗生素活菌数)X 100%，结果见图1B。由图1B可知，在不加丙氨酸的情况下，即使使用最高浓度的卡那霉素也只能杀死少量耐药菌。而加入丙氨酸后，最低浓度的卡那霉素即可明显杀死这些耐药菌，且随着加入抗生素量增多，其活菌数越少，即对抗生素敏感性越高。此结果表明丙氨酸可提高耐药菌对卡那霉素的敏感性；而且敏感性与抗生素浓度相关:抗生素浓度越高，耐药菌敏感性越高。对于EIB202，在4(^g/mL卡那霉素时可提高约120倍，在5(^g/mL卡那霉素时可提高约150倍；对于LTB4-R，在80(^g/mL卡那霉素时可提高约60倍，在100Pg/mL卡那霉素时可提高约100倍。
[0041]3、丙氨酸提高耐药菌对卡那霉素的敏感性具有作用时间的相关性:在制备好的5mL菌液中加入终浓度为分别为4(^g/mL (EIB202)或80(^g/mL (LTB4-R)卡那霉素以及40mM丙氨酸。30°C、200rpm培养8h，每隔I小时用平板检测其活菌数，计算不同时间生存率。计算公式为:生存率(％)=(加入丙氨酸后在某个时间点的活菌数/不加丙氨酸在某个时间点的活菌数)X 100%，结果见图1C。由图1C可见，与对照只加入抗生素相比，加入丙氨酸I小时后，细菌存活数开始减少，且随着时间延长活菌数越低。这些结果说明，丙氨酸可以提高耐药菌对卡那霉素敏感性，加入物质时间越长效果越明显。
[0042]实施例3丙氨酸提高耐药菌对卡那霉素的敏感性具有普遍性
1、迟缓爱德华菌其他抗生素耐药菌株的筛选和鉴定:用两倍稀释法检测迟缓爱德华氏菌LTB-4起始株(命名为LTB-S)对氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的最小抑菌浓度。将LTB-S以15菌落形成单位/毫升的数量在含1/2最小抑菌浓度氨苄青霉素或巴洛沙星或四环素的培养基中连续培养10代，重新测定其最小抑菌浓度。如果重新测定的最小抑菌浓度/起始最小抑菌浓度>4，则认为该菌株对该抗生素表现出耐药性。由图2的测定结果可知，筛选得到了氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株。
[0043]2、迟缓爱德华氏菌对多种抗生素的耐药性测定:将实验室保存的迟缓爱德华菌6种菌株(LTB4-S，LTB4-R, EIB202, WY37, WY28, ATCC15947)按照实施例1 中的第 I 步方法，分别测定对卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、红霉素、氯霉素和利福平的最小抑菌浓度，结果见图3。从图3可看出，这些迟缓爱德华菌都是多重耐药菌。
[0044]3、丙氨酸提高野生耐药迟缓爱德华菌及其耐药菌对卡那霉素的敏感性:将迟缓爱德华菌其他菌株(LTB4-S，LTB4-R, EIB202, WY37, WY28, ATCC15947，氨苄青霉素、巴洛沙星和四环素的耐药菌株)按照实施例1中的第3步试验过程分别制备试验用样本。然后在加入4(^g/mL卡那霉素(除LTB4-R为80(^g/mL外)前提下，在每种样品中加入或不加入40mM的丙氨酸。3(TC、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为:生存率(％)=(加入代谢物后的活菌数/不加代谢物的活菌数)X 100%。结果见图4A.由图可知，当加入物质后，活菌数都明显减少，对于丙氨酸，活菌数减少了 5~123倍。这个结果说明丙氨酸不仅可提高迟缓爱德华多重耐药菌对卡那霉素的敏感性，而且可提高迟缓爱德华菌其他抗生素耐药菌对卡那霉素敏感性，表明丙氨酸提高细菌对卡那霉素敏感性具有普遍性。
[0045]4、丙氨酸可提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性:将多种其他病原菌(副溶血弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、MASA和肺炎克雷伯菌)按照实施例1中的第3步试验过程分别制备试验用样本。然后在加入适量庆大霉素(副溶血弧菌25Pg/mL、乙型链球菌25Pg/mL、金黄色葡萄球菌8Pg/mL、MASA 6.4Pg/mL和肺炎克雷伯菌lPg/mL)前提下,在每种样品中加入或不加入40mM的丙氨酸。30°C、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为:生存率(％)=(加入丙氨酸后的活菌数/不加丙氨酸的活菌数)X100%。结果见图4B。由图可知，当加入丙氨酸后，不同病原菌活菌数都发生减少现象。对于副溶血弧菌，活菌数减少了近1000倍；对于乙型链球菌，活菌数减少了近30倍；对于金黄色葡萄球菌，活菌数减少了近3倍；对于MASA和肺炎克雷伯菌，活菌数减少了近20% ；这个结果说明丙氨酸可提高多种病原菌对庆大霉素的敏感性。
[0046]实施例4丙氨酸可提高迟缓爱德华菌对多种抗生素的敏感性
将制备好的EIB202样本分别用庆大霉素(16Pg/mL)、头孢他啶(3.2Pg/mL)、巴洛沙星(1.6Pg/mL)、氨曲南(32Pg/mL)、头孢唑林钠(256Pg/mL)、新霉素(6.4Pg/mL)和吉他霉素(1.6Pg/mL)共7种抗生素处理。每种抗生素处理组分为2组，分别为仅加抗生素的对照组和加抗生素与40mM丙氨酸的试验组。30°C、200rpm培养6小时后，用平板检测其活菌数，计算加入物质后存活率。计算公式为:生存率(％)=(加入物质后的活菌数/不加物质的活菌数)X100%。从图5结果可以看出，加入物质后活菌数比只加抗生素对照组的活菌数都有下降，但不同抗生素作用效果不同。对于庆大霉素，作用非常显著，加丙氨酸后可提高300多倍；新霉素可提高5倍，其余均可提高近1.5倍。
[0047]实施例5丙氨酸通过提高细菌PMF使进入胞内抗生素含量增多而提高细菌对抗生素敏感性
PMF (质子动力势)测定:将制备好的EIB202细菌样本分成2组:加生理盐水组和40mM丙氨酸组。30°C、200rpm 培养 6 小时后，米用 BacLight bacterial membrane potentialkit (Invitrogen)试剂盒测定PMF。过程简述如下:分别取上述每种处理菌液16CFU,力口A 10 μ L 3 mM D1C2 (3，3’-diethyloxa_carbocyanine 1dide),室温孵