oRNA_29b inhibitor 或 2'0Me-microRNA_29b，其可 以通过商业购置获得,其中microRNA-29b inhibitor包含如SEQ ID NO. 27所示的序列。
[0027] 本发明所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间 充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
[0028] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0029] 主要试剂和仪器：microRNA_29b inhibitor 和 microRNA_29b inhibitor negative control购自Ambion公司；抑制microRNA_29b干扰慢病毒载体pGLVU6/GFP系统 购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamin? 2000试剂盒购于invitrogen公司；PCR 引物由Invitrogen公司合成；X型胶原免疫组化染色使用的免疫组化染色试剂盒购于北京 中杉金桥生物技术有限公司；兔抗小鼠 X型胶原一抗购于Abeam公司；CFX 96Touch梯度突 光定量PCR仪购自Bio-rad公司；0LYMPUS-IX71显微镜购自奥林巴斯株式会社；其它试剂 和仪器均为本领域常规使用试剂和仪器。
[0030] 实验动物：C57小鼠和新西兰健康大白兔均由第三军医大学第三附属医院动物所 提供。
[0031] 本发明所述细胞培养基具体为：
[0032] 培养基A :不含TGF-β 3不完全软骨诱导培养基，由以下成分组成：低糖DMEM培养 基，1 % ITS混合生长因子（含有6. 25 μ g/mL胰岛素、6. 25 μ g/mL转铁蛋白、6. 25ng/mL亚 硒酸、I. 25mg/mL牛血清白蛋白和5. 35μ g/mL亚油酸），1%双抗（lOOmg/mL链霉素和100U/ mL青霉素），50μ g/mL维生素 C,40y g/mL脯氨酸，IOOnM地塞米松；其中百分比均指质量百 分比。
[0033] 培养基B :含TGF-β 3完全软骨诱导培养基（10ng/mL TGF-β 3)，由以下成分组成： 低糖DMEM培养基，1 % ITS混合生长因子（含有6. 25 μ g/mL胰岛素、6. 25 μ g/mL转铁蛋白、 6. 25ng/mL亚硒酸、I. 25mg/mL牛血清白蛋白和5. 35 μ g/mL亚油酸），1%双抗（100mg/mL链 霉素和lOOU/mL青霉素），50 μ g/mL维生素 C，40 μ g/mL脯氨酸，IOOnM地塞米松；其中百分 比均指质量百分比。
[0034] 培养基C :肥大化软骨诱导完全培养基，培养基B中去除TGF-β 3,降低地塞米松浓 度至InM并添加20-100ng/mL的Τ3。
[0035] 实施例1间充质干细胞细胞培养及成肥大化软骨分化诱导实验
[0036] (1)小鼠骨髓间充质干细胞获取及培养
[0037] 无菌条件下，用ImL注射器冲洗小鼠股骨骨髓，并将其转入盛有5mL DMEM培养基 的离心管中，轻轻吹打制成细胞悬液；将细胞悬液转入到含5mL淋巴细胞分离液的离心管 中，在2000r/min条件下离心20min ;离心后收集云雾状白膜层的单个核细胞并置于另一离 心管中，用〇1^1低糖培养基洗涤两次，离心（100〇1'/11^11，51^11)后弃上清液，用含15 (%胎牛 血清的DMEM基础培养基重悬细胞，最后将该原代细胞以I X IO6个/mL的细胞浓度接种于 培养瓶中，并置于37°C，5% (302恒温培养箱中培养。培养过程中每隔3天换一次培养液，待 细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。显微镜下观察大部分细胞呈宽大多角形或扁 平状的成熟间充质干细胞。
[0038] (2)间充质干细胞成肥大化软骨分化诱导实验
[0039] 取长势良好的细胞，待细胞融合至80?90%时，用0. 25%胰蛋白酶消化细胞，然 后用培养基A (不含TGF- β 3不完全软骨诱导培养基）重悬细胞，再将细胞按2. 5 X IO5个/ 管分装至15mL离心管中，0. 5mL/管，500g离心10min，离心结束后直接将离心管放到37°C， 5% CO2恒温培养箱中培养。每隔2-3天更换一次培养基B (含TGF- β 3完全软骨诱导培养 基），培养过程中细胞微团呈自由悬浮状态。从第15天开始实验组细胞团更换培养基C (肥 大化软骨诱导完全培养基），对照组培养基不变。MSCs成软骨肥大化分化诱导过程中，细胞 微团自由悬浮在离心管中，随诱导时间长短不同细胞团大小无明显差异，无明显松散出现。
[0040] 实施例2microRNA-29b表达增加促进软骨细胞肥大化进程
[0041] (1)取软骨诱导分化14d、21d和28d的细胞团，提取总RNA并反转录为cDNA。反 转录具体操作如下：将PCR管置于冰上，并分别加入5yL 5XRT Reaction Buffer、lyL 25mM dNTP 混合液、1 μ L 25U/ μ L RNA 酶抑制剂、1 μ L 200U/ μ L M-MLV 反转录酶和 4 μ L 的 DEPC水，然后加入RNA与引物的混合物使反应总体积为25 μ L，将上述组分混匀后42°C水浴 60min，最后加热到85°C灭火处理5min即得到cDNA溶液，将溶液置于-70°C保存备用。
[0042] 于Nucleotide数据库获取小鼠来源的II型胶原（Col II )、X型胶原（Col X)、Sox9 以及内参基因 GAPDH的mRNA序列，用Primer Premier 5. 0软件设计相应的PCR引物，各引 物如下：
[0043] Col II基因上游引物：5, -ggtggagcagcaagagcaa-3'（SEQ ID NO. 1);
[0044] Col II基因下游引物：5, -agtggacagtagacggaggaaa-3，（SEQ ID NO. 2);
[0045] Col X 基因上游引物：5，-tctgctgctaatgttcttgacc-3'（SEQ ID NO. 3);
[0046] Col X 基因下游引物：5, -tttatggcgtatgggatgaag-3，（SEQ ID NO. 4);
[0047] Sox9 基因上游引物：5，-ctcagcaagactctgggcaa-3'（SEQ ID NO. 5);
[0048] Sox9 基因下游引物：5, -gggctggtacttgtaatcgg-3'（SEQ ID NO. 6);
[0049] Runx2 基因上游引物：5，-ccaacttcctgtgctccgtg-3'（SEQ ID NO. 7);
[0050] Runx2 基因下游引物：5，-ataacagcggaggcatttcg-3，（SEQ ID NO. 8);
[0051] HDAC4 基因上游引物：5，-cactcctctacggcacaaatcc-3'（SEQ ID NO. 9);
[0052] HDAC4 基因下游引物：5，-ccaacaccaccacaaggaagc-3'（SEQ ID NO. 10);
[0053] GAPDH 基因上游引物：5，-tacattgccttccgtgttcctacc-3，（SEQ ID NO. 11);
[0054] GAPDH 基因下游引物：5，-agtttgacctcagatgcctgcttc-3，（SEQ ID NO. 12);
[0055] 使用All-in-〇ne?qPCR Mix试剂盒将Col II和Col X的cDNA产物分别配制荧光 实时定量PCR反应体系，体系包括2XAll-in-〇ne qPCRMix 10μ?，2μΜ的PCR特异引物F 2μ L，2yM特异弓丨物 R 2μ L，cDNA 2μ L，CldH2O 4μ L ;反应条件为：94°C，5min ;94°C，30s， 35次循环；57°C，30s ;72°C，30s ;80°C，20s (收集荧光）。为建立PCR产物的熔解曲线，扩增 反应结束后从72°C缓慢加热到99°C。
[0056] (2)检测microRNA-29b的表达反应体系：向去RNA酶的PCR管中加入总RNA 1 μ g， 2. 5U/μ L PolyA 聚合酶 1 μ L，RTase Mix 1 μ L，5 X PAP/RT 缓冲液 5 μ L，1 μ M RT 特异性引 物0. 5 μ L，剩余用CldH2O补至25 μ L。RT反应在PCR扩增仪中进行，反应条件：16°C，30min ; 42°C，40min ;85°C，5min，得到的终产物即为cDNA溶液。
[0057] 突光实时定量PCR反应：用Primer Premier 5. 0软件设计的miRNA特异性引物序 列如下，U6作为内参：
[0058] U6 基因上游引物：5，-gcttcggcagcacatatactaaaat-3'（SEQ ID NO. I3);
[0059] U6 基因下游引物：5，-cgct