一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程及肿瘤学领域，尤其涉及一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是一种世界范围内的普通癌症，在东亚地区属于高发癌症。常年以来，医疗工作者在乳腺癌的发病机理和新的诊断标志物和治疗目标方面做了大量研究，然而在乳腺癌的发病机理方面仍没有突破进展。近年来，在传统的癌症基因和肿瘤抑制基因的研究已经拓展到一个新的种类-微小核糖核酸(microRNAs),微小核糖核酸(以下称miRNA)的发现提供的一种研究治疗癌症的新的契机。miRNA作为新发现的基因表达调控因子，是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNA，可抑制靶基因转录或蛋白翻译从而沉默靶基因的表达。近年来众多研究表明miRNA在肿瘤转移的过程中起到了关键作用，其主要以干预miRNA翻译的方式负向调控基因的表达，参与肿瘤转移的发生发展。研究表明，某些miRNA在不同肿瘤表达具有特异性，可作为某些肿瘤诊断的标志物，从而提高肿瘤的诊断和治疗，为人类肿瘤治疗提供了新的方向和手段。
[0003]目前应用于临床的乳腺疾病诊断方法有10余种,但真正较为成熟或有较好应用前景的诊断乳腺癌的手段尚不多，尤其是对早期临床症状、体征不明显的患者。而血清miRNA检测是一种损伤小、稳定性好、灵敏度和特异性更高的方法，为肿瘤的诊断及miRNA在肿瘤中的机制研究开辟了新的途径。
【发明内容】
[0004]为了更好地诊断乳腺癌，本发明提出了一种新的与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物，本发明还提供了上述血清微小核糖核酸标志物在乳腺癌的辅助早期诊断中的应用。
[0005]本发明通过分离和研究乳腺癌患者和与其匹配的健康女性的对照血清miRNA，寻找一种与乳腺癌高度相关的高特异性和敏感性的miRNA，并为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]—种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物，该标志物为miR-21。
[0008]上述与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物miR-21在乳腺癌的辅助早期诊断中的应用。
[0009]本发明采集符合标准的血液样本，系统收集完整的临床资料，并采用Real-timePCR等方法对血清miRNA:miR-214, miR-21和miR-195进行分析。
[0010]具体的实验方法主要包括以下几个部分:
[0011]1、标本的准备:选取乳腺外科的女性乳腺癌病人血清以及同期年龄匹配的正常女性体检的血清，标本离体后，保存于-80°C冰箱备用。所有病例均确诊为乳腺癌，临床资料完整，均未接受放化疗。
[0012]2、总 RNA 的提取:用 mirVana?PARIS?Kit (Life Tech)提取细胞总 RNA，具体步骤参照说明书操作，分别提取乳腺癌病例及正常女性血清中的总RNA。
[0013]3、逆转录合成cDNA第一链:逆转录过程按照所购逆转录试剂盒的操作说明书进行。
[0014]4、荧光定量聚合酶链反应(qPCR):荧光定量聚合酶链反应(qPCR)体系使用了目的miRNA和内参miRNA以及qPCR试剂盒。PCR程序为95°C，1min ;95°C，15s ;60°C退火延生，共40个循环。
[0015]5、采用SPSS21.0分析，数据以均数土标准差表示。血清miRNA的表达量在乳腺癌组和对照组中的比较，miRNA的表达量和乳腺癌患者的临床病理特征的关系均用两个独立样本的Mann-Whitney U检验。利用ROC曲线来确认miR-21鉴别乳腺癌患者及健康者的诊断价值。P〈0.05为有统计学意义。
[0016]优选的:所述荧光定量聚合酶链反应(qPCR)体系中的内参miRNA为miR_16。
[0017]优选的:所述荧光定量聚合酶链反应(qPCR)在ABI PRISM7500Real-time系统上完成。
[0018]优选的:用2_act的方法来分析中乳腺癌患者和健康人血清中miRNA的表达量。
[0019]通过上述实验及分析筛选出在乳腺癌病例和健康女性对照中表达量差异程度大的一种血清miRNA，作为辅助乳腺癌诊断的指标。最后筛选出的与乳腺癌发病有关的血清miRNA为miR-21，其可以为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持。
【附图说明】
[0020]图1是本发明提出的一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物miR-21和血清微小核糖核酸标志物miR-214、miR-195在乳腺癌患者及健康人血清中的表达。
[0021]图2是本发明提出的一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物miR-21的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0022]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0023]采集符合标准的血液样本，系统收集完整的临床资料，并采用Real-time PCR等方法对血清微小核糖核酸miR-214，miR-21和miR-195进行分析。
[0024]具体的实验方法主要包括以下几个部分:
[0025]1、标本的准备:选取乳腺外科的女性乳腺癌病人血清40例以及同期年龄匹配的正常女性体检的血清10例，标本离体后，保存于-80°C冰箱备用。所有病例均确诊为乳腺癌，临床资料完整，均未接受放化疗。
[0026]2、总RNA的提取:-80 °C保存的血清室温中充分溶解，抽吸混匀。用mirVana?PARIS?Kit (Life Tech)提取细胞总RNA。取625 μ I体积的血浆到无RNase EP 管加等体积的 2Χ Denaturing Solut1n 混勻，冰浴 5min ;再加 1.25mlAcid-Phenol:Chloroform润旋60s,室温1000g离心5min,使混合液分层；吸取上层水相300 μ I加入375 μ I的无水乙醇,混勻J^Filter Cartridges柱子放到收集管中，将混合液加到柱子中，室温1000g离心30s，弃液，将柱子放回收集管中；加700 μ ImiR WashSolut1nl到柱子中，室温1000g离心30s，弃液，将柱子放回收集管中；加500 μ I WashSolut1n2/3到柱子中，室温1000g离心30s，弃液，重复一次，室温1000g空甩Imin弃去废液，将柱子放回一新的收集管中；加100μ 195°C预热的Elut1n Solut1n到柱子中；室温1000g离心30s，所获溶液即为RNA溶液。
[0027]3、逆转录合成cDNA第一链:往EP管里面加入以下试剂:100mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μ I, MultiScribe?Reverse Transcriptase, 50U/ μ L1.00 μ I, 10X ReverseTranscript1n Buffer1.50 μ I, RNase Inhibitor, 20U/μ L0.19 μ I, Nuclease-freewaterl.16 μ I, 5X RT primer has—miR—161.5 μ I, 5X RT primer has—miR—2141.5 μ I, 5X RTprimer has-miR-211.5 μ I, 5X RT primer has—miR—1951.5 μ 1，RM samp I e5.00 μ I昆勾，冰浴 5min，接着 16°C干浴 30min，42°C干浴 30min，85°C干浴 5min，_80°C保存 cDNA。
[0028]4、荧光定量聚合酶链反应(qPCR):用 TAQMAN UNIVERSAL MMIXII，NO UNG(LifeTech)进行 PCR 反应(20 μ I 体系):10μ I TaqMan2 X Universal PCR Master Mix,8 μ I Nuclease-freewater,I μ I cDNA,I μ I TaqManMicro-RNA Assay (X 20)；反应条件:95 V 1min预变性，95 V 15s和60°C退火延伸，40个循环。PCR反应在ABIPRISM7500Real-time 系统上完成。
[0029]5、采用SPSS21.0分析，数据以均数土标准差表示。血清miRNA的表达量在乳腺癌组和对照组中的比较，miRNA的表达量和乳腺癌患者的临床病理特征的关系均用两个独立样本的Mann-Whitney U检验。利用ROC曲线来确认miR-21鉴别乳腺癌患者及健康者的诊断价值。P〈0.05为有统计学意义。
[0030]统计学分析结果:
[0031]运用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法分别检测乳腺癌患者血清和正常人血清中的miR-214，miR-21和miR-195的表达量。这三个miRNA在血清中的表达量公式为:2_ACT，其中Λ CT = CTmiRNA-CTmiR-16，通过log2的正态性转换得到-Λ CT, miR-214在乳腺癌患者血清及正常对照组血清中的表达量分别为-9.09±1.77，-9.45±1.24，miR-21在乳腺癌患者血清及正常对照组血清中的表达量分别为-3.40±1.92，-6.23±2.15，miR-195在乳腺癌患者血清及正常对照组血清中的表达量分别为-7.43±0.81，-7.49±2.06。
[0032]如图1:miR-214,miR-21和miR-195在乳腺癌患者及健康人血清中的表达所示,经统计学分析发现，miR-21在乳腺癌患者血清及正常对照组血清中的表达量有差异，差异有统计学意义(P〈0.01);而miR-214和miR195在乳腺癌患者和正常对照组血清中的表达量的差异无统计学意义(Ρ>0.05)
[0033]如图2:miR-21的ROC曲线所示，ROC曲线分析提示miR-21是一个用来区别健康人和乳腺癌患者较好的诊断指标。ROC曲线下面积为0.828(95%的置信区间:0.697?0.958)，敏感性和特异性分别为80%和70%，相应的诊断界值是0.0343 (2-ACT)。
[0034]通过上述实验及分析筛选出在乳腺癌病例和健康女性对照中表达量差异程度大的一种血清miRNA，作为辅助乳腺癌诊断的指标。最后筛选出与乳腺癌发病有关的血清miRNA为miR-21，其可以为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持。
[0035]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物，其特征在于，该标志物为:miR-21。2.如权利要求1所述的与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物在乳腺癌的辅助早期诊断中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用。本发明通过血清标本的准备，总RNA的提取，逆转录合成cDNA第一链，荧光定量聚合酶链反应（qPCR），用统计学方法进行数据分析等5个步骤，确定了一种新的与乳腺癌相关的血清微小核糖核酸标志物，该标志物可应用于乳腺癌的辅助早期诊断。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN105200055
【申请号】CN201410275342
【发明人】周伟民, 钟婧, 戴利成
【申请人】湖州市中心医院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年6月19日