一种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物及其筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种贝类线粒体cox3 [细胞色素c氧化酶亚基III (cytochrome coxidase subunit III)]基因的扩增引物，特别是涉及一种北方常见経类线粒体cox3基因的扩增引物及其筛选方法。
【背景技术】
[0002]経类属软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，异齿亚纲(Heterodonta)，帘蛤目(Veneroida)，生活于潮间带至数百米水深的海域，是常见的经济贝类。特别是大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏，在我国分布很广，是我国沿海群众所喜爱的海产贝类之一，在食用贝类中占有重要地位。
[0003]近年来，由于过度采捕、海洋环境的日益恶化以及栖息地萎缩，蛏类的资源量逐年下降，急需加快对其多样性的评估，为种质资源的合理开发利用和保护奠定基础。线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial DNA,即mtDNA)由于具有母系遗传、缺少重组、进化速度快等特点，被广泛应用于群体遗传多样性评估、物种鉴定、系统发生学等领域。近几年来，由于分子生物学技术的不断进步，mtDNA的测定数量不断增长。mtDNA的获得主要采用步移法与鸟枪法，其中步移法成本低，操作简单，最为常用。步移法使用Long-PCR技术，Long-PCR引物的设计依赖于线粒体基因组短片段序列的获得。得到的短片段序列越多，越有助于得到基因组全长。目前大竹蛏、长竹蛏、缢蛏的mtDNA已经测定完成，小刀蛏的mtDNA序列还未见报道。在采用步移法测定小刀蛏的mtDNA过程中，利用coxl基因与16S rRNA基因的短片段设计的Long-PCR引物有一对没有扩增成功，阻碍了全长的获得。开发适用性好的cox3基因扩增引物可加快线粒体基因组的测序进展，有利于蛏类的遗传多样性评估、种质资源保护与利用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。
[0005]—种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox3序列；b、将下载的序列用B1Edit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物；d、对采集的大竹経、长竹経、小刀経和缢蛏个体提取DNA，分别与合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物cox3CF和cox3CR:cox3CF为5’TATCATTTAGTHGATATAAGACC 3， ； cox3CR 为 5， CCATGAAADCCAGTTATYACAA 3，。
[0006]本发明筛选出一对用于扩增北方常见蛏类线粒体部分cox3序列的引物cox3CF和cox3CR，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够满足蛏类线粒体基因组研究以及后续的遗传多样性与系统发生学研究的需要。
【具体实施方式】
[0007]实施本发明的北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物时，分以下五步:
1、下载序列:登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)，下载已有的大竹経、长竹経、溢経线粒体全序列中的cox3序列(Genbank登录号为:HQ703012、JN786377 和 JN398366)。
[0008]2、序列比对:用序列处理软件 B1Edit (http://www.mb1.ncsu.edu/B1Edit/b1edit, html)对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端较保守区域。
[0009]3、引物设计与合成:经比对后在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件 Primer Premier 5 (http://www.premierb1soft.com/primerdesign/index.html)设计引物，设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。设计的多对引物交由上海生工生物技术有限公司合成。
[0010]4、DNA提取:对采自山东沿海的大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体用苯酚-氯仿法提取DNA，加双蒸水稀释为100 ng/ μ I的工作液备用。
[0011]5、引物扩增:在ΙΟμΙ PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这些个体的cox3 片段，该体系包括:100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer(Mg2+plus), 0.2 mM dNTPs，引物各 I μ M。PCR扩增条件为:94 °C预变性 3 min，94 °C变性45s，46-54 °C退火45s，72 °C延伸45s，共35个循环，最后72 °C延伸5 min。
[0012]本实验扩增出的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的一对引物 cox3CF (5，TATCATTTAGTHGATATAAGACC 3，)和 cox3CR (5，CCATGAAADCCAGTTATYACAA 3’):该引物的最佳退火温度为50°C，产物片段长度约580bp。
【主权项】
1.一种北方常见蛏类线粒体C0X3基因的扩增引物，其特征是该引物为一对，引物条带单一、扩增效率高，分别是 cox3CF 和 cox3CR ；cox3CF 为 5’ TATCATTTAGTHGATATAAGACC 3’ ；cox3CR 为 5， CCATGAAADCCAGTTATYACAA 3，。2.根据权利要求1所述的一种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物，其特征是该引物的最佳退火温度为50°C，产物片段长度约580bp。3.权利要求1所述的一种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物的筛选方法，包含以下步骤: a、下载序列:登陆美国国立生物技术信息中心下载已有的大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox3序列； b、序列比对:将下载的序列用序列处理软件B1Edit进行多重比对分析，确定出两端保守区域； C、引物设计与合成:在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计引物，设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现；交由有合成条件的机构合成； d、DNA提取:对采集的大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，加双蒸水稀释为.100 ng/ μ I的工作液备用； e、引物扩增:在10μ I PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这些个体的cox3片段，该体系包括:100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+plus)，0.2 mM dNTPs，引物各 I μ M ;PCR 扩增条件为:94 °C预变性 3 min, 94 °C变性 45s，.46-54 °C退火45s，72 °C延伸45s，共35个循环，最后72 °C延伸5 min。
【专利摘要】本发明涉及一种北方常见蛏类线粒体cox3基因的扩增引物及其筛选方法，扩增引物cox3CF为5’？TATCATTTAGTHGATATAAGACC？3’；？扩增引物cox3CR为5’？CCATGAAADCCAGTTATYACAA？3’；？扩增引物的制备方法包含下载序列、序列比对、引物设计与合成、DNA提取、引物扩增五步；本发明筛选出一对用于扩增北方常见蛏类线粒体部分cox3序列的引物cox3CF和cox3CR，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够满足蛏类线粒体基因组研究以及后续的遗传多样性与系统发生学研究的需要。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN105200047
【申请号】CN201510612242
【发明人】冯艳微, 刘相全, 韦秀梅, 姜绪, 王卫军
【申请人】山东省海洋资源与环境研究院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日