黄瓜线粒体基因组ssr标记开发及其在种子纯度鉴定中的应用
【专利摘要】本发明基于黄瓜线粒体父系遗传的特性，使用线粒体基因组SSR标记技术鉴定黄瓜杂交种纯度的一种方法，涉及黄瓜线粒体基因组SSR标记开发，用开发的黄瓜线粒体标记分别对不同生态型的黄瓜品种进行多态性筛选，以及利用多态性标记对黄瓜F1种子进行纯度检测，属于生物技术育种领域。本发明首次应用黄瓜线粒体基因组序列开发SSR标记来检测黄瓜杂种一代种子纯度，以期区分母本黄瓜植株上其他花粉来源的假杂交种和自交种，相对于核基因组SSR标记技术对品种鉴定方面的研究，其主要利用黄瓜线粒体父系遗传特性而多了一种新的检测方法，同时为追踪杂交过程中父系/母系线粒体基因组做技术准备。该方法也可以应用于其他父系植物材料杂种一代种子的检测。
【专利说明】
黄瓜线粒体基因组SSR标记开发及其在种子纯度鉴定中的应用
一、技术领域
[0001]本发明黄瓜线粒体基因组SSR标记开发及其在种子纯度鉴定中的应用属于生物技术育种领域，涉及黄瓜线粒体基因组SSR标记开发，用开发的黄瓜线粒体标记分别对不同生态型的黄瓜品种进行多态性筛选，以及利用多态性标记对黄瓜F1种子进行纯度检测。
二、技术背景
[0002]黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。一般认为，黄瓜起源于印度，中国是黄瓜的次生起源中心之一，可分为华北型、华南型、欧洲温室型、欧洲露地型、野生型以及加工型6个生态类型(周长久，1994)。随着我国农业经济的发展和种植业的调整，蔬菜生产的重要性越来越受到重视(李巧英，2009)，对蔬菜种子质量的关注也日益提升。而种子纯度是种子质量的核心指标，由于种子繁育复杂、有限的亲本资源及新杂交种F1的不断增加，其制种过程中形成的假杂种会给黄瓜生产及农民经济收入造成重大损失。传统检验种子纯度的方法主要包括种子形态鉴定和田间小区种植表型鉴定，其检验费时费力且易受环境、人为等影响，也不能有效区分遗传关系较近的杂交种(Salgado et al, 2006);同工酶鉴定的结果可靠性较差，受环境影响大。因此建立一套稳定可靠、简单快速的黄瓜种子纯度鉴定方法显得十分重要。
[0003]近年来，DNA分子标记技术日趋完善并广泛用于农作物和蔬菜种子的真实性检测和纯度鉴定(盖树鹏和盂祥栋，2003 ;柳李旺等，2004 ;Yashitola et al，2002)。其中，SSR(Simple sequence repeat)标记因具有数量丰富、多态性高、操作简便、结果稳定可靠等优点，成为当前最经济、最有效的分子标记技术，也为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效、简便、可靠的方法(李巧英，2009)。目前，SSR标记广泛地被应用于大豆(关荣霞等，2003)、玉米(李艺等，2008)及水稻(陈年伟等，2009)等作物的杂交种纯度鉴定。SSR分子标记在黄瓜杂交种子纯度鉴定中的应用将对黄瓜种子产业的规范以及促进农业增产和农民增收方面具有重要意义。
[0004]不同于绝大多数植物细胞器的母系遗传规律，黄瓜种内及种间杂交研究结果表明黄瓜线粒体为父系遗传(Calderon et al, 2012 ；Shen et al, 2013),且短的分散重复序列占黄瓜线粒体基因组的13% (Alverson et al, 2011),理论上为线粒体标记开发和应用奠定了基础。由于线粒体基因组在种属间具有很高的保守性，因此，线粒体基因组SSR不仅具有SSR标记固有的特点，而且还具有很好的种属通用性，已被广泛应用于物种的起源、进化及种质资源多样性分析等研究领域(杨新泉等，2007)。
[0005]本研究根据已有的黄瓜线粒体基因组序列信息开发SSR标记，在探索黄瓜种内线粒体DNA的多态性的同时，根据黄瓜线粒体父系遗传的特点筛选mtSSR引物，并将筛选出的多态性mtSSR标记应用于黄瓜F1种子的快速纯度鉴定,建立一套稳定可靠、简单快速的黄瓜种子纯度鉴定方法。三、
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明的目的是提供一种黄瓜杂交种纯度检测的方法，以期区分母本黄瓜植株上其他花粉来源的假杂交种和自交种，其主要利用黄瓜线粒体父系遗传特性而多了一种新的检测方法，同时为追踪杂交过程中父系/母系线粒体基因组做技术准备。该方法也可以应用于其他父系植物材料杂种一代种子的检测。
[0008]技术方案
[0009]本发明基于黄瓜线粒体父系遗传特性提供一种黄瓜杂交种纯度检测的方法，其实施方案如下:
[0010]1.黄瓜线粒体基因组SSR标记开发:
[0011]I)黄瓜线粒体基因组中有三个环化染色体，其中所有可辨的完整线粒体基因都在 1556kb 长的染色体 I 上。从 GenBank 公共数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中以FASTA格式下载黄瓜线粒体基因组染色体I全序列(HQ860792.1)，使用搜索工具SSRIT(http://www.gramene.0rg/db/searches/ssrtool)对上述黄瓜线粒体基因组数据进行SSR位点的搜索，筛选标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置为5，4，3，3，3次及以上；
[0012]2)基于所获得的线粒体微卫星序列，利用在线引物设计软件Primerf.0 (http://frod0.w1.mit.edu/)设计黄瓜线粒体SSR引物，引物配对序列避免微卫星的出现。引物设计主要参数为:引物长18?22bp，以20bp为最佳；引物退火温度50?60°C，前后引物退火温度之差避免超过2 V ;6(:%含量40?60%，最适50% ;PCR预期产物长100?300bp。避免错配、引物二聚体或发夹结构的出现。研究发现，黄瓜线粒体基因组中含有丰富的从叶绿体和细胞核中转移而来的序列，反之亦然。使用序列比对检索工具BLAST搜索，剔除与黄瓜核基因组及叶绿体基因组相匹配的引物。
[0013]2.对开发出的黄瓜线粒体SSR标记进行多态性筛选:
[0014]I)以30份黄瓜自交系品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增。SSR反应体系总体积为25 μ L:灭菌ddH20 17.3uL, 1Xreact1nbuffer (MgCl2) 2.5 μ L, 2mmol L MNTP 2 μ 1，正反向 SSR 引物(1umol L1)各 luL，模板DNA (30ng uL I μ L,5 U.μ L 1Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L。线粒体 SSR 参照核基因组 SSR 扩增程序，优化后确定为:94°C预变性5min ;然后94°C变性45s，60°C退火45s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存。用每对引物分别对30个黄瓜自交系样品进行PCR扩增；
[0015]2)PCR扩增结束后，采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；
[0016]3)对呈现多态性的标记带型进行回收测序，并对测序后的序列记性分析并与核基因组和叶绿体基因组进行比对，得到具有线粒体基因组多态性的黄瓜品种，为杂种一代种子纯度验证提供亲本。
[0017]3.杂种一代群体验证:
[0018]I)利用‘Amir’、‘407 Beit Alpha’和‘北京截头’ 3个黄瓜品种，通过人工授粉进行正反杂交，获得4个黄瓜杂交种组合F1种子(‘Amir’ X ‘407 Beit Alpha’、‘407 BeitAlpha，X ‘Amir’、‘Amir’ X ‘北京截头’和‘北京截头’ X ‘Amir’ )；
[0019]2)随机抽取杂交后代FAO株、父母本材料各5株。提取黄瓜基因组DNA，利用筛选出的2对线粒体特异性标记进行种子纯度鉴定，重复3次，并将鉴定结果与田间形态鉴定结果进行比较，分析2种方法的一致性，验证黄瓜线粒体SSR分子标记在种子纯度鉴定上的可行性。
[0020]有益效果
[0021]本发明黄瓜线粒体基因组SSR标记开发及其在种子纯度鉴定中的应用，具有如下优点和积极效果:
[0022]I)本发明利用黄瓜线粒体基因组序列开发的SSR标记探索了黄瓜种内线粒体DNA的多态性；
[0023]2)本发明首次应用黄瓜线粒体基因组序列开发SSR标记来检测黄瓜杂种一代种子纯度，以期区分母本黄瓜植株上其他花粉来源的假杂交种和自交种，相对于核基因组SSR标记技术对品种鉴定方面的研究，其主要利用黄瓜线粒体父系遗传特性而多了一种新的检测途径；
[0024]3)应用本发明的方法鉴定黄瓜杂交种纯度，可进一步被应用于其他父系遗传植物的相关研究中，同时为追踪杂交过程中父系/母系线粒体基因组做技术准备。
四、【附图说明】
[0025]图1:黄瓜线粒体SSR引物筛选。
[0026]图中，M=Marker ;1_30:30 份黄瓜自交系;1_A:引物 mtSSR4 ;1_B:引物 mtSSR1 ；
1-C:引物 mtSSR29 ;1_D:引物 mtSSR44。
[0027]图2:黄瓜杂交种F1种子纯度检测。
[0028]图中，M:Marker ;图 2-A:1_5:母本 ‘407 Beit Alpha，;6_10:父本 ‘Amir’ ；11-30:‘407Beit Alpha，X ‘Amir’ ；图 2_B:1_5:母本 ‘Amir’ ;6_10:父本 ‘407 Beit Alpha，；
I1-30: ‘Amir’ X ‘407Beit Alpha，(引物 mitSSR4)。图 2~C:1_5:母本‘北京截头’ ;6_10:父本 ‘Amir’ ；11-30: ‘北京截头’ X ‘Amir’ 图 2_D:1_5:母本 ‘Amir’ ;6_10:父本‘北京截头’ ；11-30: iAmir, X ‘北京截头’(引物 mitSSR1)。
五、【具体实施方式】
[0029]众所周知，植物细胞器的遗传方式大多数为母系遗传，即线粒体跟随母细胞进入受精卵。而黄瓜的相关研究表明其线粒体基因为父系遗传，也就是线粒体是跟随精子进入到受精卵之中。本发明基于黄瓜线粒体父系遗传特性，以此确定了黄瓜线粒体基因组SSR标记在种子纯度检测方面的可行性。
[0030]本实施以不同生态型的黄瓜品种作为材料，采用引物设计和序列比对软件开发黄瓜线粒体基因组标记，验证了应用黄瓜线粒体SSR标记检测杂种一代种子纯度(图2)。实验过程如下:
[0031]1.黄瓜线粒体基因组SSR标记开发:
[0032]I)黄瓜线粒体基因组中有三个环化染色体，其中所有可辨的完整线粒体基因都在 1556 kb 长的染色体 I 上。从 GenBank 公共数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中以FASTA格式下载黄瓜线粒体基因组染色体I全序列(HQ860792.1)，使用搜索工具SSRIT(http://www.gramene.0rg/db/searches/ssrtool)对上述黄瓜线粒体基因组数据进行SSR位点的搜索，筛选标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置为5，4，3，3，3次及以上；
[0033]2)基于所获得的线粒体微卫星序列，利用在线引物设计软件Primerf.0 (http://frod0.w1.mit.edu/)设计黄瓜线粒体SSR引物，引物配对序列避免微卫星的出现。引物设计主要参数为:引物长18?22bp，以20bp为最佳；引物退火温度50?60°C，前后引物退火温度之差避免超过2 V ;6(:%含量40?60%，最适50% ;PCR预期产物长100?300bp。避免错配、引物二聚体或发夹结构的出现。研究发现，黄瓜线粒体基因组中含有丰富的从叶绿体和细胞核中转移而来的序列，反之亦然。使用序列比对检索工具BLAST搜索，剔除与黄瓜核基因组及叶绿体基因组相匹配的引物。
[0034]2.黄瓜基因组DNA提取及检测:用改良的CTAB法[21]对黄瓜基因组DNA进行提取，经2uL RNase (1ug.mL ')消化后，用I %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，_20°C冰箱保存备用。
[0035]3.对开发出的黄瓜线粒体SSR标记进行多态性筛选:
[0036]I)以30份黄瓜自交系品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增。SSR反应体系总体积为25 μ L:灭菌ddH20 17.3uL, 1Xreact1nbuffer (MgCl2) 2.5 μ L，2mmol.L MNTP 2 μ 1，正反向 SSR 引物(1umoI L》各 IuL,模板DNA (30ng uL I μ L,5 U.μ L 1Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L。线粒体 SSR 参照核基因组 SSR 扩增程序，优化后确定为:94°C预变性5min ;然后94°C变性45s，60°C退火45s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存。用每对引物分别对30个黄瓜自交系样品进行PCR扩增；
[0037]2) PCR扩增结束后，采用8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；
[0038]3)对呈现多态性的标记带型进行回收测序，并对测序后的序列记性分析并与核基因组和叶绿体基因组进行比对，得到具有线粒体基因组多态性的黄瓜品种，为杂种一代种子纯度验证提供亲本。
[0039]4.杂种一代群体验证:
[0040]I)利用‘Amir’、‘407 Beit Alpha’和‘北京截头’ 3个黄瓜品种，通过人工授粉进行正反杂交，获得4个黄瓜杂交种组合F1种子(‘Amir’ X ‘407 Beit Alpha’、‘407 BeitAlpha，X ‘Amir’、‘Amir’ X ‘北京截头’和‘北京截头’ X ‘Amir’ )；
[0041]2)随机抽取杂交后代FAO株、父母本材料各5株。提取黄瓜基因组DNA，利用筛选出的2对线粒体特异性标记进行种子纯度鉴定，重复3次，并将鉴定结果与田间形态鉴定结果进行比较，分析2种方法的一致性，验证黄瓜线粒体SSR分子标记在种子纯度鉴定上的可行性。
【主权项】
1.黄瓜线粒体基因组SSR标记开发: 1)黄瓜线粒体基因组中有三个环化染色体，其中所有可辨的完整线粒体基因都在1556kb 长的染色体 I 上。从 GenBank 公共数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中以FASTA格式下载黄瓜线粒体基因组染色体I全序列(HQ860792.1)，使用搜索工具SSRIT(http://www.gramene.0rg/db/searches/ssrtool)对上述黄瓜线粒体基因组数据进行SSR位点的搜索，筛选标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置为5，4，3，3，3次及以上； 2)基于所获得的线粒体微卫星序列，利用在线引物设计软件Primerf.0(http://frod0.w1.mit.edu/)设计黄瓜线粒体SSR引物，引物配对序列避免微卫星的出现。引物设计主要参数为:引物长18?22bp，以20bp为最佳；引物退火温度50?60°C，前后引物退火温度之差避免超过2 V ;6(:%含量40?60%，最适50% ;PCR预期产物长100?300bp。避免错配、引物二聚体或发夹结构的出现。研究发现，黄瓜线粒体基因组中含有丰富的从叶绿体和细胞核中转移而来的序列，反之亦然。使用序列比对检索工具BLAST搜索，剔除与黄瓜核基因组及叶绿体基因组相匹配的引物。2.对权利I开发出的黄瓜线粒体SSR标记进行多态性筛选: 1)以30份黄瓜自交系品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增。SSR反应体系总体积为 25 μ L:灭菌 ddH20 17.3uL, 10 Xreact1n buffer (MgCl2) 2.5 μ L, 2mmo1L 1ClNTP 2 μ 1，正反向 SSR 引物(1umoI L ” 各 luL，模板 DNA (30ng uL I μ L, 5U.μ L 1TaqDNA聚合酶0.2 μ L。线粒体SSR参照核基因组SSR扩增程序，优化后确定为:94°C预变性5min ;然后94°〇变性458，601:退火45s，72。。延伸30s，共35个循环;最后72°C延伸7min，4°C保存。用每对引物分别对30个黄瓜自交系样品进行PCR扩增； 2)PCR扩增结束后，采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像； 3)对呈现多态性的标记带型进行回收测序，并对测序后的序列记性分析并与核基因组和叶绿体基因组进行比对，得到具有线粒体基因组多态性的黄瓜品种，为杂种一代种子纯度验证提供亲本。3.杂种一代群体验证: 1)利用‘Amir’、‘407BeitAlpha，和‘北京截头’ 3个黄瓜品种，通过人工授粉进行正反杂交，获得4个黄瓜杂交种组合F1种子(‘Amir’ X ‘407Beit Alpha’、‘407BeitAlpha，X ‘Amir’、‘Amir’ X ‘北京截头’和‘北京截头’ X ‘Amir’ )； 2)随机抽取杂交后代FAO株、父母本材料各5株。提取黄瓜基因组DNA，利用权利2筛选出的2对线粒体特异性标记物进行种子纯度鉴定，重复3次，并将鉴定结果与田间形态鉴定结果进行比较，分析2种方法的一致性，验证黄瓜线粒体SSR分子标记在种子纯度鉴定上的可行性。4.根据权利I和2所述，利用开发出的黄瓜线粒体SSR标记可以实现对大量杂交后代分子标记的筛选，以快速有效地进行杂交种纯度检测。
【文档编号】C12Q1/68GK105886602SQ201410727972
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月1日
【发明人】陈劲枫, 李海梅, 沈佳, 娄群峰, 李季, 钱春桃
【申请人】南京农业大学