专利名称：：水稻大粒基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因技术和植物学领域。更特别的，本发明涉及一种新的水稻大粒基因及其应用。
背景技术：
：水稻产量是由粒重、穗数、粒数三大性状决定的。这些性状是由多个数量性状基因(QTL)控制的数量性状。近IO年来应用分子标记技术定位了许多产量相关性状的QTL，但被成功克隆的基因还很少。2005年日本科学家成功克隆了1个控制水稻粒数的基因(foh)，并阐明了该基因的分子机理，相关成果发表在Science上，引起国际上的广泛关注。此外，虽然最近有定位于第三染色体的一个控制粒长基因^^被克隆的报道，但没有对其进行相关功能分析。然而，控制粒重的相关基因的克隆和功能研究至今还没有获得真正的成功。粒重是决定产量的最重要性状之一，开展粒重基因的克隆和功能研究，以便应用于作物高产分子育种，具有重大理论意义和实用价值。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的可用于控制作物籽粒大小的水稻大粒基因及其应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的水稻大粒蛋白，该蛋白选自下组(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有控制作物粒宽或粒重功能的由(a)衍生的多肽。在本发明的另一优选例中，所述的蛋白来源于水稻。在本发明的另一优选例中，所述的蛋白具有E3连接酶活性。在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的水稻大粒蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在本发明的另一优选例中，该多核苷酸选自下组(1)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或(2)SEQIDNO:1中255—1532位所乐的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或它的基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的第五方面，提供所述的水稻大粒蛋白或其编码基因的用途，用于控制作物籽粒的粒宽或粒重(更优选的，为增加作物籽粒的粒宽或粒重，从而增加作物产量)；调节细胞过程；或作为鉴定作物大粒品种和小粒品种的分子标记。在本发明的另一优选例中，所述的细胞过程包括但不限于细胞分裂、信号传导、细胞伸长。在本发明的第六方面，提供一种改良作物(更优选的，为增加作物籽粒的粒宽或粒重)的方法，该方法包括(A)降低所述作物中水稻大粒基因的表达；或(B)将功能降低或功能缺失的水稻大粒基因或蛋白导入作物中。在本发明的另一优选例中，将功能降低或功能缺失的水稻大粒基因或蛋白导入小粒品种的作物中，从而可促进作物籽粒变大。更优选的，将功能缺失的水稻大粒基因或蛋白导入作物中。在本发明的另一优选例中，用分子标记选择技术将从大粒品种的作物中获得的GW2基因片段导入小粒品种的作物中。该方法为非转基因方法，没有安全隐患O在本发明的第七方面，提供一种所述的水稻大粒蛋白或其编码基因的激动剂或拮抗剂。在本发明的第八方面，提供一种能与所述的水稻大粒基因或其编码蛋白特异性结合的抗体。在本发明的第九方面，提供一种制备转基因植物的方法，所述的方法包括步骤将所述的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述的植物细胞，再生成植物。在本发明的另一优选例中，所述方法包括步骤(Sl)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的蛋白的编码基因；(s2)将植物细胞或组织或器官与步骤(sl)中的农杆菌接触，从而使所述蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(s3)选择出转入所述的蛋白编码基因的植物细胞或组织或器官；以及(s4)将步骤(S3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。在本发明的第+方面，提供一种剁客所逑的蛋白的方法，所逑方法包括-培养所述的宿主细胞，收集获得所述的蛋白。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了水稻G『2反义转基因植株(AS3，AS24，AS25)的谷粒与受体品种"中花11(ZH11)"的谷粒的比较。图2显示了水稻G『2正义转基因植株(S21，S22，S24)的谷粒与受体品种"中花ll(ZHll)"的谷粒的比较。图3显示了用分子标记选择方法(非转基因方法)将大粒G『2基因片段导入小粒品种对小粒品种粒重的影响。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首先发现了一种控制作物籽粒粒宽和/或粒重的新基因，该基因的功能的缺失可产生大粒的表型，本发明人将之命名为水稻大粒基因(GV2)。试验证实，G『2基因过量表达的转基因植株的粒型变小、粒重减少，GW2基因降低表达的转基因植株的粒型变大、粒重提高，可见d。基因将在农作物高产育种中起重要作用，具有广泛的应用前景。在此基础上完成了本发明。如本文所用，所述的"作物"包括但不限于禾本科植物。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于小麦、大麦、玉米、高粱等。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"分离的GW2蛋白或多肽"是指所述的GW2蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GW2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是夭然纯化的产物，或是化学佥成的产物，或使用童组技米从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括GW2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天然GW2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语"GW2蛋白"指具有GW2蛋白活性的SEQIDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与GW2蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最佳地1-10个，还更佳如l-8个、l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为IO个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GW2蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GW2蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GW2蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GW2蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GW2蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有GW2蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供GW2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然GW2蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括夭然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，"GW2蛋白保守性变异多肽"指与SEQIDN0:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。例如，这些保守性变异多肽可根据表l进行氨基酸替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明还提供了编码本发明GW2蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA:DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:l所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:l所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指:(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS，6CTC;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1。/。小牛血清/0.P/。Fico11，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GW2蛋白的多聚核苷酸。应理解，虽然本发明的GW2基因优选得自水稻，但是得自其它植物的与水稻GW2基因高度同源(如具有80。/。以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。本发明的GW2蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GW2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，19S4;224:1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GW2蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码GW2蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，GW2蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GW2蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养，当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。重组的GW2蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗GW2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组GW2蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激GW2蛋白功能的多肽分子，所获得的GW2蛋白的拮抗剂或激动剂也包括在本发明的范围内。另一方面，本发明还包括对GW2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于GW2基因产物或片段。较佳地，指那些能与GW2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。较佳的，本发明中抗体是那些能够结合并抑制GW2功能的分子。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的GW2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达GW2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256;495,1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,ElsevierN.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用GW2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与GW2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如ECo/力中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。本发明中的抗体可用于抑制作物中GW2的功能。利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GW2蛋白或基因发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用GW2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GW2蛋白的转录产物。本发明还涉及一种使作物籽粒变大的方法，该方法包括降低所述植物中GW2基因或其同源基因的表达。降低GW2基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的，比如可通过采用GW2蛋白的拮抗剂、抗体等来中和或阻止GW2的表达。或者，可通过在植株中导入丧失GW2基因功能的GW2基因片段，来实现作物的籽粒变大。本发明的GW2基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。此外，本发明还涉及GW2基因的分子标记选择技术在农作物大粒高产育种中的应用。作为本发明的一个实例，本发明人以WY3(特大粒品种)与丰矮占1号(小粒品种)杂交构建遗传群体，应用分子标记技术定位了一个位于第二染色体的控制水稻粒宽和粒重的新基因GW，并且通过图位克隆技术克隆了该基因。G基因的基因组长度为5.877kD，包含有8个外显子，7个内含子，其cDNA长度为1.634Kb，全长0RF(0penReading-Frame)长度为1.278Kb，编码1条含有425个碱基的蛋白，蛋白产物分子量估计为47KDa。在本发明的一个实例中，发现一种GW2基因的第4外显子上发生1个碱基的缺失，产生提前终止密码子，造成缺少310个氨基酸，使^2基因功能缺失，从而产生大粒的表型。作为本发明的另一个实例，本发明人从水稻品种"中花11"中获得一条C股的变异基因，由于该基因的碱基第1041位(E卩0RF的第787位)C—T变异导致提前出现终止密码子，导致其编码的蛋白缺失部分氨基酸序列。然而，该植株仍然表现出小粒表型，证明尽管发生了缺失变异，然而仍然保持了"W蛋白的功能。作为本发明的另一个实例，本发明人从水稻品种"黄华占"中获得一条f殿的变异基因，该基因的碱基第1041位(即0RF的第787位)也发生了C—T变异，提前出现终止密码子，导致其编码的蛋白缺失部分氨基酸序列。然而，该植株仍然表现出小粒表型，也即保持了5松蛋白的功能。GW2蛋白含有一个RING功能域，在本发明的一个实例中，本发明人经过蛋白酶活性功能分析结果表明，GW2具有蛋白降解途径中的E3连接酶活性。蛋白降解途径参与细胞过程如细胞分裂，因此籽粒的大小可能与GW2具有E3连接酶活性有关。在本发明的一个实例中，本发明人将小粒水稻品种的G基因的全长cDNA分别按正义和反义方向置于CaMV35S启动子的控制下，分别构建到水稻表达载体上。通过农杆菌介导法将2种表达载体导入水稻品种中花11中。对阳性转化植株进行表型观察表明，反义6￥2由于降低该基因的表达导致转基因植株的粒型明显增大、粒重明显增重(图1)，而正义过量表达f则由于增加该基因的表达引起转基因植株的粒型变小、粒重减少(图2)。表明G基因在控制水稻粒重中起着重要的作用，通过分子设计该基因可以显著提高水稻产在本发明的--个实例中，本发明人通过分子标记选择技术将大粒品种的^^基因片段导入小粒品种中显著地提高粒重，千粒重由原来的22克增加到32克，增幅高达46%(图3)。该技术由于是非转基因方法，可以免除转基因安全评价，没有安全隐患。表明^基因在水稻等作物高产育种中具有广泛的应用刖景。本发明的主要优点在于(1)首次分离得到一种新的水稻大粒基因，降低该基因的表达可使得作物(如水稻)的籽粒变大，从而可增加作物的产量。(2)本发明的水稻大粒基因GW2可以作为控制作物籽粒大小，提高产量和品质的一个基因，应用于作物品种的改良。并且，可将GW2基因的分子标记选择技术用于农作物大粒高产育种。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照以下文献中公布的方法CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造厂商所建议的条件。实施例1水稻大粒基因的获得WY3是巨大粒水稻品种(千粒重达48克)，而丰矮占1号(FAZl)为小粒水稻推广优质品种(千粒重仅22克)。本发明人以WY3与丰矮占1号杂交构建遗传群体，利用分子标记定位了一个控制水稻粒宽和粒重的新基因(或QTL)G，该基因位于第二染色体上。进一步利用图位克隆技术克隆了G基因，其基因序列如SEQIDNO:1所示，编码一条含有425个碱基的蛋白，如SEQIDNO:2所示。序列比较分析表明，大粒品种的e基因存在3个碱基变异，2个为碱基替换，但未造成氨基酸改变；而另1个变异是在第4外显子上发生1个碱基(A316,0RF的第316位)的缺失，引起读码框移位，在其后的30个碱基后面产生提前终止密码子，造成缺少310个氨基酸，使G基因功能缺失，从而产生大粒的表型。水稻G/^基因的cDNA序列(来自小粒品种丰矮占1号，为正常基因)如下(SEQIDNO:1)，其中，下划线所示为开放阅读框。ccaccccgagaaagccaaaaaaaagaaaaattgtttttcaaaaaaaaagctcgcctagccctcgcgtcgtcgtccccatcaccccccctcctccgctccgagtacgcgtgcgtataccaccacctccatctccaccaccgtatgtatctacggtgaggcggcggcggcggaggaggaggaggagggggagtggtgagggtttcatctgcggaggaggagggaggaggagggaggagggtagatctgggagggggATGGGGMCAGGATAGGGGGGActctcccttgcgctgctgttgctgcccttctctcccctgcctcctgcttctgcctcctttttgccaccag水稻a^基因所编码的氨基酸序列如下(SEQIDNO:2)，其中，在发生碱基缺失变异后，产生提前终止密码子，造成缺少310个氨基酸(下划线所示)，从而使C2基因的功能缺失cMetGlyAsnArglleGlyGlyArgArgLysAlaGlyValGluGluArgTyrThrArgProGlnGlyLeuTyrGluHisArgAspUeAspGlnLysLysLeuArgLysLeiilleLeiiGluAlalysLeuAlaProCysTyi:MetGlyAlaAspAspAlaAlaAlaAlaAlaAspLeuGluGluCysProIleCysPheLeuTyrTyrProSerleuAsnArgSerLysCysCysLysThrProSerTyrAlaValGluTyrArgGlyVa比ysThrlysGluGluArgSerlleGluGlnPheGluGluGlnLysValIleGluAlaGlnMetArgMetArgGlnGinAlaLeuGlnAspGluGluAspLysMetLysArgLysGlnAsnArgCysSerSerSerArgThrlleThrProThrLysGluValGluTyrArgAspIleCysSerThrSerPheSerValThrHisSerGlnGlyLeuAlaTrpLeu实施例2水稻大粒基因的变异形式本发明人以水稻品种"中花11"为研究对象，从小粒表型的"中花11"中获得一条的变异基因，由于该基因的碱基第1041位(0RF的第787位)C—T变异导致提前出现终止密码子，导致其编码的蛋白缺失部分氨基酸序列。该植株表现出小粒表型，证明尽管发生了缺失变异，然而仍然保持了^^2蛋白的功能。本发明人以水稻品种"黄华占"为研究对象，获得一条GW的变异基因，该基因的碱基第1041位(ORF的第787位)也发生了C—T变异，提前出现终止密码子，导致其编码的蛋白缺失部分氨基酸序列。该植株仍然表现出小粒表型，也即保持了^2蛋白的功能。此外，本发明人还从水稻小粒表型的植株中获得了ffW基因第368位(0RF的第114位)T—C变异，该变异没有导致氨基酸(Ile)的变化。该植株仍然表现出小粒表型，也即该变异对于G股基因的功能没有影响。此外，本发明人还从水稻小粒表型的植株中获得了《殿基因第1370位(ORF的第1116位)G—A变异，该变异没有导致氨基酸(Ala)的变化。该植株仍然表现出小粒表型，也即该变异对于G^2基因的功能没有影响。实施例3^^的分子标记辅助选择育种实验本实施例中在a^基因内设计PCR寡核苷酸引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)，用Taq酶进行PCR扩增大粒品种与小粒品种的DNA,用限制性内切酶fco/I酶切扩增产物，经过1°/。琼脂糖凝胶电泳检测出大粒品种与小粒品种之间存在DNA多态性(差异)，大粒品种的分子量为1.159kb，小粒品种的分子量为0.88kb，因此该引物发展成特异性鉴别大粒G基因与小粒C基因的分子标记。在大粒品种与小粒品种的杂交后代群体中用该分子标记可以快速地将携带大粒基因的个体挑选出，达到进一步培育大粒高产新品种的目的。5'端寡核苷酸引物序列为-5，-TGTTGTTGCGAGAGTAGGG-3，(SEQIDNO:3);3'端引物序列为5，-TCGGTTAAGACTTGGGTAG-3，(SEQIDNO:4)。实施例4G松水稻转基因实验本实施例采用来源于植物表达载体pCAMBIA3301的双元载体pHB(Mao等，2005，PNAS102:12270-12275)作为水稻转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan0、潮霉素抗性基因(Hyg0、除草剂抗性基因(Bar)、CaMV35S启动子、N0S基因的终止信号序列以及后两者之间的限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可正向或反向插入G的cDNA构建成转基因质粒。1.6T^正义过量表达的转基因质粒构建在本实施例中，以来源于小粒品种的RNA为模板，合成第一条链cDNA，用该DNA序列的5，和3'端的PCR寡核苷酸为引物(SEQIDN0:5和SEQIDNO:6)，用高保真Taq酶pfuTaq进行扩增，获得1.634kb的全长cDNA扩増产物。将该扩增产物通过历/^III和Sa历HI限制性酶切重组进PMD18-T(购自TAKARA)相应的限制性内切酶克隆位点，并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。该重组的过渡质粒载体称为"-PMD。5'端寡核苷酸引物序列为5，-CCACCCCGAGAAAGCCAAAA-3，(SEQIDNO:5);3'端引物序列为-5，-CTGGTGGCAAAAAGGAGG-3，(SEQIDNO:6)。用历/7t/III和S柳HI消化G-PMD和载体pHB，将6￥2-PMD消化后的1.634kb目的片段连接到载体pHB的III和5柳HI酶切位点中。连接物转化大肠杆菌菌株DH5a，在含有Kan(5(^gZml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用III和A3迈HI酶解挑选出有约1.6Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建pHB-35S-6￥2质粒。2.^2反义超表达的转基因质粒构建以来源于小粒品种的RNA为模板，合成第一条链cDNA，用该DNA序列的5'和3'端的PCR寡核苷酸为引物(SEQIDNO:7和SEQIDNO:8)，用高保真Taq酶pfuTaq进行扩增，获得1.278kb的全长ORF扩增产物，然后连接到载体pHB的^i/tiIII禾n万細HI酶切位点中。重组子的鉴定与前述方法相同，这样成功构建pHB-35S-G(反义)质粒。5'端寡核苷酸引物序列为5，-ATGGGGAACAGGATAGGGGGGAG-3，(SEQIDNO:7);3'端引物序列为5，-CTACAACCATGCCAACCCTTGCGAG-3，(SEQIDNO:8)。3.GM转化水稻上述两种重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105。每200WEHA105感受态细胞与0.5-lPg(约l.OW)质粒DNA混匀，依次在冰上、液氮中和37°C水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至lml，于28。C振摇培养2-4小时；取200W涂布于含抗生素Kan(5(mg/ml)的YEB平板上，28。C培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ral含抗生素的YEB液体培养基中于28'C振摇培养过夜，第2天按1%接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD,为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4。C离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1°C、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26t:共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Kir基因活化物，使用浓度为100Wiiol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1(Hyg25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2(Hyg50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS。H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA,经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因Tl代观察水稻粒型表型，验证^^基因功能。实施例5水稻6^反义转基因植株与水稻6T正义转基因植株以及分子标记(非转基因)导入大粒GW2片段植株的谷粒大小比较1.^y反义转基因植株与野生型的比较如实施例4所述的方法获得水稻tfF反义转基因植株，用转基因Tl代观察水稻粒型表型，观察^F基因对于谷粒大小的影响。结果见图1。由图1可见，水稻^反义转基因植株(AS3，24，25)的谷粒明显比受体品种中花ll(ZHll)大。2.Glf正义转基因植株与野生型的比较如实施例2所述的方法获得水稻^F正义转基因植株，用转基因Tl代观察水稻粒型表型，观察G/T基因对于谷粒大小的影响。结果见图2。由图2可见，水稻GF正义转基因植株(S21，22，24)的谷粒明显比受体品种中花11(ZH11)小。3.大粒GM基因片段导入小粒品种对小粒品种粒重的影响对大粒品种WY3与小粒品种丰矮占1号进行杂交获得Fl代，以小粒品种丰矮占1号作为轮回亲本进行多次回交，然后用实施例3中所描述的分子标记从回交后代中选择出携带大粒^^基因片段而遗传背景为小粒品种的植株，这样将大粒67^基因片段导入小粒品种(FAZ1)中。分子标记选择方法为非转基因方法，具有没有安全隐患的优点。结果如图3所示。结果表明，将大粒f基因片段导入小粒品种中，可明显提高小粒品种的水稻粒重。水稻的千粒重由原来的22克增加到32克，增幅高达46%。实施例6GW2的蛋白分析1.抗体制备以上述实施例所获得的1.278kb全长0RF，用ffi刀t/III和fe历HI重组到pET32a(+)(购自Novagen公司)。将重组有02的原核表达载体pET32a(+)转化入大肠杆菌BL21(DE3)，IPDG诱导原核表达，然后用His-tag珠纯化蛋白。用经纯化的蛋白免疫兔子，通过常规方法获得抗GW2的抗体。2.检测抗体效价WesternBlotting检测GW2过量表达的表达量，并同时以未转化亲本、空质粒及反义转基因植株作负对照，GW2原核表达蛋白作为正对照。3.免疫组织化学分析检测GW2蛋白量的变化，并进行GW2的组织及亚细胞定位。4.E3连接酶活性的研究将重组有0^的原核表达载体pET32a(+)转化入大肠杆菌BL21(DE3)，0.5%乳糖、低温(12'C)诱导原核表达，以无损伤方法从原核表达菌株中提取和纯化活性GW2蛋白，用于研究GW2是否有E3连接酶活性。本实施例中的泛素连接酶活性反应采用XiurenZhang等类似的方法(见XiurenZhang等，cfe"ev.200519:1532-1543)。简述如下30ul体系，包括有5mMMgCl2，0.33mMDTT，50mMTris-HC1(PH7.4)，2mMATP,0.125ugEl，0.2ugE2(UbcH5b),lugE3，另外在反应体系中加入2ul大肠杆菌粗提液。反应在30摄氏度中温浴3小时。之后加入1XSDS-PAGE加样缓冲液100摄氏度温浴5分钟终止反应。反应效果通过12。/。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。泛素化蛋白利用Westernblotting通过anti-Ubiquitin检湖!j。上述实验结果表明，GW2具有蛋白降解途径中的E3连接酶活性，因而提示其与细胞事件如细胞分裂有关。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。中国科学院上海生命科学研究院<120〉水稻大粒基因及其应用<130〉065312<160〉9<170〉Patentlnversion3.3序列表<210>1〈211〉1634<212>DNA<213>稻属(0ryzasativaL.〈220〉<221〉<222〉CDS(255)..(1532)<400〉1ccaccccgagaaagccaaaaaaaagaaaaattgtttttcactcgcgtcgtcgtccccatcaccccccctcctccgctccgc.acctccatctccaccaccgtatgtatctacggtgaggcgggagggggagtggtgagggtttcatctgcggaggaggagggatctgggagggggatggggaacaggataggggggGlyAsnArggtgValateI]eccgPro45gagGlutgtCysactThrtatTyrgagGlugacAsp30tgcCystgcCystgcCysHisgetAla110gagGlu15cagGintacTyrcccProteaSeractThr95gtgValaggArgaagLysatgMetatelieaaaLys80getAlagagGluMet1tac丁yr犯gLysggcGlytgcCys65gggGlycagGintatTyracgThretcLeugccAla50ttcPheliecctProcgtArgaggArgeggArg35gacAspctgLeutgcCysThrggtGly115ccgPro20LysgacAsptacTyrThrc肌Gin10()Va].lie5c汪gGinctgLeugccAlat￡LCTyrgagGlu85tgtCys卿aaaaaaaagctcgcctagccagtacgcgtgcgtataccacgeggeggeggagg鄉鄉agaggaggagggatgg郷gt^agg鄉鄉gcggggGlyGlyArgArgLysAlaGly10gggctgtacgagcacagggacGlyLeuTyrGluHisArgAspliegccAlaPro70tgcCysProThretcLeugccAla55agtSertttPhettcPhe鄉LysgagGlu40gccAlacttLeuetcLeutgcCysgagGlu120gagGlu25gccAlagccAlaAsncaaGinaaaLys105Glu鄉LysgacAspcgaArgatgMet90actThraggArgetcLeuetcLeuteaSer75LysProgcgAlagagGlu60aagLyscccProageSeragtSerlie60120180240290338386434482530578626<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>ageategaagaacagatgatgttttecatggetSerlieGluGluGinMetMetPheSerMetAla400405ggtcatggaagaacacactegcaagggttggcaGlyHisGlyArgThrHisSerGinGlyLeuAla415420gtagagcactctaattttgacgccttgctgccctctcccttctctcccctgcctcctgcttctgcctcctttttgccaccctttctttagcagatLeuSerLeuAlaAsp410tggttgtagTrpLeu425tgcgctgctgttgctgccct3g1490153215921634<210〉2<211〉425〈212〉PRT<213>稻属(OryzasativaL.)<400〉2MetGly1TyrThrLysHeuGlyAla50CysPhe65GlylieGinProTyrArgGluGin130GinAsp145SerArgSerThrGluCysProPhe210GluAsp225GlySerAsnArgArg35AspLeuCysThrGly115LysGluThrSerCys195HisMetlieProSerProArglieGlyGlyArgArgLysAlaGlyValGluGluArg51015ProGinGlyLeuTyrGluHisArgAsplieAspGinLys202530LysLeulieLeuG〗uAlaLysLeuAlaProCysTyrMet4C45AspAlaAlaAlaAlaAlaAspLeuGluGluCysProlie5560TyrTyrProSerLeuAsnArgSerLysCysCysSerLys707580ThrGluCysPheLeuGinMetLysProThrHisThrAla859095GinCysProPheC》sLysThrProSerTyrAlaValGlu100105110ValLysThrLysGluGluArgSerlieGluGinPheGlu120125VallieGluAlaG〗nMetArgMetArgGinGinAlaLeu135140GluAspLysMetLysArgLysGinAsnArgCysSerSer150155160lieThrProThrLysGluValGluTyrArgAspI]eCys165170175PheSerValProSe:rTyrArgCysAlaGluGinGluThr180185190SerSerGluProSerCysSerAlaGinThrSerMetArg200205SerArgHisAsnArgAspAspAsnlieAspMetAsnI丄e215220MetValMetGluA]alieTrpArgSerlieGinGluGin230235240GlyAsnProValCysGlyAsnPheMetProValThrGlu245250255ArgGluArgGinProPheValProAlaAlaSerLeuGlu260265270I]eHsPhe3〔)5SerProAspAspAsn385GinThrProGin290ProMetSerHislie370PheMetHisHis275ProValCysCysTrp355ValAlaMetSerGlyProPheAsnSer340SerAlaMetPheGin420GlySerAspLeu325ArgGluAspAlaSer405GlyGlyMetMet310GluGluGlyAlaPro390MetLeuPheSer280AspPhe295PheArgSerSerVa〗ValAlaGlu360GlyThr375SerHisAlaLeuAlaTrpCysAlaValAlaSerArgProArg345AlaMetPheSerLeu425TyrMetAla300ProCysAsn315GluSerTrp330GluGluGlyGlyThrSerProGinLeu380ArgProGlu395LeuAlaAsp410AlaMetAlaG]u285GlySerSerAlalieAlaGlySerGlylie335GluCysSer350TyrAlaGly365ProPheAlaSerlieG丄uGlyHisGly415Gly320AlaAlaSerGluGlu400Arg<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉3tgttgttgcgagagtaggg19<210>4<211〉19<212>DNA<213〉人工序列〈220><221>misc一feature<223〉引物<400>4tcggttaagacttgggtag19〈210〉5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature〈223〉引物〈■■400〉5cc.axxccgagaaagccaa3a(:210〉6<211>18<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>6ctggtggcaaaaaggagg〈210〉7〈211〉23<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉7atggggaacaggataggggggag<210〉8<211〉25<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<221〉raise—feature<223〉引物<400〉8ctacaaccatgccaacccttgcgag说明书第23/23页20182权利要求1.一种分离的蛋白，共特征在于，该蛋白选自下组(a)具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有控制作物粒宽或粒重功能的由(a)衍生的多肽。2.如权利要求l所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白来源于水稻。3.如权利要求l所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白具有E3连接酶活性。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求l所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(1)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或(2)SEQIDNO:1中255-1532位所示的核苷酸序列。7.—种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。8.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体；或它的基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。9.权利要求l所述的蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于控制作物籽粒的粒宽或粒重；调节细胞过程；或作为鉴定作物大粒品种和小粒品种的分子标记。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的细胞过程包括细胞分裂、信号传导、或细胞伸长。11.一种改良作物的方法，其特征在于，该方法包括(A)降低所述作物中权利要求l所述的蛋白的表达；或(B)将功能降低或功能缺失的权利要求l所述的蛋白或其编码基因导入作物12.—种权利要求l所述的蛋白或其编码基因的激动剂或拮抗剂。13.—种能与权利要求l所述的蛋白或其编码基因特异性结合的抗体。14.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤将权利要求4所述的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述的植物细胞，再生成植物。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(Sl)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求l所述的蛋白的编码基因；(s2)将植物细胞或组织或器官与步骤(sl)中的农杆菌接触，从而使权利要求l所述的蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(s3)选择出转入权利要求l所述的蛋白编码基因的植物细胞或组织或器官；以及(s4)将步骤(s3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。16.—种制备权利要求l所述的蛋白的方法，其特征在于，培养权利要求8所述的宿主细胞，收集获得权利要求l所述的蛋白。全文摘要本发明公开了一种水稻大粒基因GW2及其应用，GW2基因可用于控制作物籽粒的大小、提高作物的产量或品质、调节细胞分裂的速度、以及作为鉴定作物大粒品种和小粒品种的分子标记。本发明还公开了一种改良作物的方法。GW2基因在水稻等作物高产育种中具有广泛的应用前景。文档编号C07K14/415GK101161675SQ20061011711公开日2008年4月16日申请日期2006年10月13日优先权日2006年10月13日发明者宋献军,敏施,朱美珍,林鸿宣,巍黄申请人:中国科学院上海生命科学研究院