专利名称：一种鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法
技术领域：
本发明涉及鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法，具体属于一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列及其操作方法。
背景技术：
冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.,别名虫草,是较常用的名贵中药材之一。它是由麦角菌科Clavicipitaceae虫草属Cordyceps冬虫夏草菌寄生在高山草甸土中生活的鳞翅目蝙蝠蛾科Ifepialidae昆虫蝙蝠蛾幼虫体内，经过营养生长和生殖生长，形成冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核构成的复合体。冬虫夏草味甘性平，具有补虚损、益精气、滋阴润肺、止血化痰、补肾强壮等功效，常用于治疗肾虚、肺气虚以及肾肺两虚引起的多种疾病，也多用做提高免疫力、抗癌、保肝、延寿等方面的保健品。目前全世界已知的虫草种类有380种，其中最有名气的是冬虫夏草。真正的冬虫夏草菌为野生，长于海拔3000-5000米的高原地 区。主要分布在西藏的那曲地区、林芝地区、昌都地区，青海的玉树地区、果洛州一带，四川的阿坝州壤塘、甘孜州理塘、巴塘、德格，云南迪庆州德钦、中甸以北一带，甘肃的甘南州玛曲以西等地。野生冬虫夏草对生存环境要求苛刻、分布地区狭窄、自然寄生率低，造成其天然资源十分稀少。加之冬虫夏草药用价值高、效果好，国内外对其需求量很大，因此价格非常昂贵，随之而来的伪劣品也层出不穷，有些伪品根据形色味也很难与真品区分。此外，不同产地冬虫夏草品质的差异也是比较大的。所有的虫草蝠蛾都是狭域分布类型，常常是同一地区，不同山脉就形成不同的种类，有时同一山脉不同坡向或沟谷也会形成不同的种类[1’2]。其中西藏那曲、昌都虫草和青海玉树虫草的品质是最高的，价格也最贵。因此，以其他产地的冬虫夏草以次充好的现象时有发生。目前鉴别冬虫夏草真伪的专利主要是依据冬虫夏草菌的核苷酸序列进行引物设计，虽然可以鉴定冬虫夏草的真伪，但是不能区分其究竟是那曲地区出产的最优质的冬虫夏草，还是别的产地冒充那曲出产的劣质的冬虫夏草，因此不能实际鉴别出冬虫夏草的品质如何。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列及其操作方法，该方法是从冬虫夏草寄主昆虫线粒体基因序列着手，以比较冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾与鳞翅目与其它昆虫线粒体基因的差别，寻找高变异区设计冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾的特异引物，通过序列测定得到寄主昆虫的线粒体相应片段序列，并确定核苷酸序列差异小于1-1.5%为同种不同个体之间的变异率，>6%即为同属不同种之间的变异率，以此标准来鉴定冬虫夏草的真伪和品质。本发明提供的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列，是冬虫夏草寄主昆虫当雄蝙蝠蛾幼虫干标本经基因组DNA提取、通用引物设计、PCR扩增、序列测定、数据分析、选定高变异率区、特异引物设计后PCR扩增得到的核苷酸序列。
本发明提供的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的操作方法，包括如下步骤:I)取西藏当雄地区采集的当雄蝙蝠蛾幼虫，经专家鉴定，脱水制备为干标本。挑选保存完好，无虫蛀霉变的干标本，将昆虫干标本剪开取出内容物，用75%酒精擦拭干标本体壁内、外侧2-3次以消除外源物质的污染。2)取一小节蝙蝠蛾幼虫干标本(约3-4mm长)，于TE(10mM Tris-HCL, 200mM EDTA,50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48小时后，取出浸泡回软后的材料采用酚/氯仿法提取蝙蝠蛾总 DNA。3)参考Simon 2006年所发表的线粒体通用引物序列和已发表的鳞翅目其它物种引物进行首轮扩增。未能得到的序列通过在GenBenk中下载相关昆虫部分线粒体基因序列或全线粒体基因组序列进行ClustalX对比寻找相关保守区域，根据引物设计的基本原则，使用Primer Primier (Ver.5.0)设计相关引物21对,覆盖了线粒体基因组所有序列。4)根据21对引物进行PCR扩增及PCR扩增产物的序列测定和拼接，得到完整的当雄編fe蛾的线粒体基因组序列。5)结合GenBank中已有的40个以及本实验室自行测定的5个(合计45个)鳞翅目昆虫线粒体基因组序列，比对后以Bombyx mori的基因组注释为基准，绿色为基因，红色为rRNA，黄色为tRNA，灰色的为D-1oop区进行两两基因组比较，得到图1。内圈三圈紫色的圆环分别代表以Bombyx mori为基准，与三种基因组两两比较的结果。其中，最外圈深紫色的为当雄蝙蝠蛾与家蚕比较的结果，中间为Ochrogaster Iunifer与家蚕比较的结果,最内圈为Papilio maraho与家蚕比较的结果。中心的圆环表示45个鳞翅目昆虫线粒体基因组一起与家蚕比较的结果:红色代表分辨率在40 45之间，蓝色为30 39，绿色为20 29,深灰色为小于20。6)依据图1结果，选择变异率最大且连续性最好的区域，分别对应于蛋白编码基因 nad2、cox3 和 atp6。7)针对这三个基因，分别设计以下三对特异引物:ND2F:ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R:TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F:GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R:ATGGGTGATTTTGATT ；C0X3F: CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R:GTAATGAAAATGGAAT。8)三对引物的扩增体系为 50μ 1，内含 0.5-1μ I TaKaRa LA Taq (5U/μ I),4-6 μ 110XLAPCR Buffer (Mg2+Plus), 7-9 μ I dNTP,上下游引物各 1-2 μ 1，0.5-2 μ I (含20-50ng DNA)模板溶液。9)三对引物PCR扩增的反应条件为预变性94°C 2分钟；35个循环，每个循环包括变性94°C 20s，退火48-55°C lm，延伸68°C 1_1.5m ;然后延展72°C 10分钟。10)PCR扩增产物采用3730测序仪双向测通，得到三个基因的序列长度分别为:nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bp。11)取被检样品提取基因组DNA，采用上述三对特异引物进行PCR扩增，如果可以分别得到3个蛋白编码基因的序列，且通过Mega软件计算三个基因联合数据集中核苷酸序列差异小于1-1.5%，即 为同种不同个体之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，且其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾；若序列差异>6%，即为同属不同种之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，但其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾属昆虫。与已有技术相比本发明具有以下特点:(I)本发明是以冬虫夏草菌寄主昆虫线粒体的3个蛋白编码基因(nad2、cox3和atp6)序列作为鉴别冬虫夏草真伪和档次(产地)的依据。这3个蛋白编码基因属于鳞翅目线粒体基因组中变异最高的区域，可以反映冬虫夏草不同寄主昆虫之间的亲缘关系远近，不仅可以鉴定待测样品是否为以蝠蛾属幼虫为寄主昆虫而形成的冬虫夏草，而且可以确定待测样品的产地，由此可知待测样品的的真伪和档次。(2)本发明的用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的操作方法步骤简单、容易操作，加之样品用量少，可以最大程度的减少样品损耗。根据本发明提供的三对特异引物，可通过检测样品中是否存在与之相同或相似的核苷酸序列及其相似度，快速方便地检测样品的真伪和档次。
具体实施例方式实施例1I)取待测冬虫夏草样品，挑选保存完好，无虫蛀霉变的干标本，将干标本剪下一小段后，剪开取出内容物，用75%酒精擦拭干标本体壁内、外侧2-3次以消除外源物质的污染。·2)将样品置于 TE(10mM Tris-HCL, 200mM EDTA, 50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡 48 小时后，取出浸泡回软后的材料采用酚/氯仿法提取蝠蛾总DNA。3)采用本发明设计的三对特异引物进行PCR扩增，引物序列为:ND2F:ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R:TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F:GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R:ATGGGTGATTTTGATT ；C0X3F: CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R:GTAATGAAAATGGAAT。4)三对引物的扩增体系为 50 μ 1，内含 0.5 μ I TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)，5μ 110XLA PCRBuffer (Mg2+Plus), 8 μ I dNTP，上下游引物各 2 μ 1，2 μ I (含 20_50ng DNA)模板溶液。5)三对引物PCR扩增的反应条件为预变性94°C 2分钟；35个循环，每个循环包括变性94°C 20s，退火48-55°C lm，延伸68°C 1.5m ;然后延展72°C 10分钟。6)PCR扩增产物采用3730测序仪双向测通，得到三个基因的序列长度分别为:nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bpo7)取被检样品提取基因组DNA，采用上述三对特异引物进行PCR扩增，如果可以分别得到3个蛋白编码基因的序列，且通过Mega软件计算三个基因联合数据集中核苷酸序列差异小于1-1.5%，即为同种不同个体之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，且其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾。实施例2I)同实施例1。I)同实施例1。2)同实施例1。3)同实施例1。
4)同实施例1。5)同实施例1。6)同实施例1。7)取被检样品提取基因组DNA，采用上述三对特异引物进行PCR扩增，如果可以分别得到3个蛋白编码基因的序列，且通过Mega软件计算三个基因联合数据集中核苷酸序列差异>6%，即为同属不同种之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，但其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾属昆虫。
图1，46种鳞翅目昆虫线粒体基因组序列变异情况比较，包括基因组注释:利用Bombyx mori的基因组注释为基准，绿色为基因，红色为rRNA，黄色为tRNA，灰色的为D-1oop.两两基因组比较:内圈三圈紫色的圆环分别代表以Bombyx mori为基准，于三种基因组两两比较的结果，每段序列以200bp为窗口，200bp为步长。其中，最外圈深紫色的为 H.amxungens 和 B.mori 比较，中间为 Ochrogaster Iunifer 和 B.mori 比较，最内圈为Papilio maraho和B.mori比较。坐标轴从内向夕卜，最内代表0，最外代表1，每0.2力口一条基准线。多种颜色组成的最内圈为所有45个基因组一起比较:红色代表分辨率在40 45之间，蓝色为30 39,绿色为·20 29,深灰色为小于20。
权利要求
1.一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列，其特征是冬虫夏草寄主昆虫当雄蝙蝠蛾幼虫干标本经基因组DNA提取、通用引物设计、PCR扩增、序列测定、数据分析、选定高变异率区、特异引物设计后PCR扩增得到的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的一种可以用于鉴别冬虫夏草真伪和品质的操作方法，其特征在于包括如下步骤 1)取冬虫夏草寄主当雄蝙蝠蛾幼虫干制标本。挑选保存完好,无虫蛀霉变的干标本,将干标本剪下一小段后，剪开取出内容物，用75 %酒精擦拭干标本体壁内、外侧2-3次以消除外源物质的污染。
2)将样品置于TE(10mMTris-HCL, 200mM EDTA, 50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48 小时后，取出浸泡回软后的材料采用酚/氯仿法提取蝠蛾总DNA。
3)设计相关引物21对，覆盖了线粒体基因组所有序列。
4)根据21对引物进行PCR扩增及PCR扩增产物的序列测定和拼接，得到完整的当雄蝙蝠蛾的线粒体基因组序列。
5)结合GenBank已有的40个以及本实验室自行测定的5种共45种鳞翅目昆虫线粒体基因组序列，比对后以Bombyx mori的基因组注释为基准获得鳞翅目昆虫线粒体基因组蛋白编码基因高变的区域。
6)依据图I结果，选择变异率最大且连续性最好的区域，分别对应于蛋白编码基因nad2、cox3和atp6。据此设计三对引物分别为ND2F ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R ATGGGTGATTTTGATT0X3F CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R :GTAATGAAAATGGAAT。
7)三对引物的扩增体系为50μ 1，内含 O. 5μ I TaKaRa LA Taq (5U/μ I), 5 μ IlOXLAPCR Buffer (Mg2+Plus)，8 μ I dNTP,上下游引物各 2 μ 1，2 μ I (含 20_50ngDNA)模板溶液。
8)三对引物PCR扩增的反应条件为预变性94°C2分钟；35个循环，每个循环包括变性94°C 20s，退火 48-55°C lm，延伸 68°C I. 5m ;然后延展 72°C 10 分钟。
9)PCR扩增产物采用3730测序仪双向测通，得到三个基因的序列长度分别为nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bpo 10)取被检样品提取基因组DNA，采用上述三对特异引物进行PCR扩增，如果可以分别得到3个蛋白编码基因的序列，且通过Mega软件计算三个基因联合数据集中核苷酸序列差异小于1-1.5%，即为同种不同个体之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，且其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾；若>6%，即为同属不同种之间的变异率，表明其为真的冬虫夏草，但其寄主昆虫为当雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾属昆虫。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别冬虫夏草真伪和品质的线粒体基因序列及其操作方法，该方法通过比较蝙蝠蛾与鳞翅目其它昆虫线粒体基因的差别，寻找高变异区。并设计昆虫蝙蝠蛾的特异引物，得到寄主昆虫的线粒体相应区段序列，并确定核苷酸差异率小于1-1.5％为同种不同个体，＞6％为同属不同种，据此不仅可以鉴定待测样品是否为以蝠蛾属幼虫为寄主昆虫而形成的冬虫夏草，而且可以确定待测样品的产地，由此可知待测样品的的真伪和档次。该方法步骤简单、易操作，加之样品用量少，可以最大程度的减少样品损耗。根据本发明提供的三对特异引物，可通过检测样品中是否存在与之相同或相似的核苷酸序列及其相似度，快速方便地检测样品的真伪和档次。
文档编号C12Q1/68GK103255200SQ20121003461
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者张敏, 王莉 申请人:上海立得生物科技有限公司