专利名称：一种普鲁兰酶及其产生菌株和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物酶技术领域，具体涉及一种新型普鲁兰酶及其产酶菌株的筛选及鉴定。本发明还提供了该普鲁兰酶生产方法、酶学特性及应用。
背景技术：
淀粉是绿色植物光合作用的产物，由直链淀粉和支链淀粉构成。其中直链淀粉主要通过α_1，4葡萄糖糖苷键连接而成，而支链淀粉还含有分支链，连接分支处的是α_1，6 葡萄糖糖苷键。淀粉是目前最为广泛应用的工业原料之一，比如制备葡萄糖浆、高麦芽糖浆等等。然而由于淀粉中含有约4% 5%的α-1，6糖苷键，使用α-淀粉酶(水解α_1，4糖苷键)无法彻底水解淀粉，影响了淀粉水解度的提高。I型普鲁兰酶(EC 3.2. I. 41)以内切方式水解普鲁兰糖或淀粉的α_1，6葡萄糖糖苷键(Doman-Pytka M et al. , Critical Reviews in Microbiology, 2004, Vol 30，Issue 2，107-121)，因此I型普鲁兰酶具有很重要的工业应用价值。工业上利用α -淀粉酶和普鲁兰酶协同作用能够彻底水解淀粉，制备高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒发酵度等； 另外，将普鲁兰酶直接作用于淀粉能够生产高直链淀粉、缓慢消化淀粉，这些产物在食品、 环保、医疗行业中都具有重要的作用。普鲁兰酶极大的提高了淀粉资源的利用率，然而目前国内外分离所得的产普鲁兰酶菌株的产酶酶活较低(一般2 5 U/mL)，且价格昂贵，限制了其在工业上的应用。这些产酶菌株主要来源于芽孢杆菌属{Bacillus')和克雷伯菌属),未见通过实验方法从气单胞菌属中筛选到产普鲁兰酶菌株。本发明首次从稻田土壤中筛选到一株具有普鲁兰多糖降解能力的气单胞菌属菌株sp. As),其所产的普鲁兰酶能够水解普鲁兰多糖和淀粉中的α-I，6糖苷键，不能水解α-I，4糖苷键，鉴定其为I型普鲁兰酶。该酶可应用于以淀粉质为原料的加工业中。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种产酶酶活高的产普鲁兰酶菌株。本发明的第二个目的在于提供该普鲁兰酶菌株发酵方法。本发明利用唯一碳源法从稻田土壤中获得了一种产普鲁兰酶的菌株As，该菌种保藏号为CGMCC NO. 5490，保藏日期为2011年11月28号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为3G2。对该菌株的16S rDNA (SEQ ID NO I)系统发育树分析(见图1)，表明该菌株来源于细菌中的气单胞菌属(命名为Jeroffioaas sp. As)。其 16S rIMk序列与Aeroinonaspunctata菌种相似度为99%。该菌株显微形态为短杆菌，在LB 平板上菌落为圆形较大，微白色透明，边缘光滑，菌落中间凸起，菌体粘稠(见图2)。本发明为国内外首次通过实验的方法筛选到气单胞菌属来源的产普鲁兰酶菌株。本发明还提供上述产普鲁兰酶的菌株的发酵方法(即用普鲁兰酶菌株产普鲁兰酶的方法)，具体步骤如下对As菌株进行分离纯化后，挑取单菌落接种于15-25 mL种子培养基中(该培养基组分为可溶性淀粉1_2%，蛋白胨O. 5-1. O %，酵母粉O. 1-0. 3 %，MgSO4
7H20 O. 02- O. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余为水；pH 6. 5-7. 5),28-32 °C，震荡培养 16 18 h ;随后取1-2 mL转接入25-50 mL发酵培养基中(该培养基组分为可溶性淀粉 1-2 %，蛋白胨 O. 5-1. 5 %，酵母粉 O. 5-1. O %，MgSO4 · 7H20 O. 02-0. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余为水；pH 6. 5-7. 5)，28-32 1震荡培养36-60 h。其摇瓶发酵产生的I型普鲁兰酶的酶活为24.8 U/mL (见图3)。本发明使用分子截留量为50 KDa的Amicon超滤管对50 mL发酵上清液进行浓缩截流，并更换背景缓冲液为20 mM的Tris-HCl (pH8. O)。取浓缩初步纯化后的酶液进行后续的酶学特性分析。通过薄层层析(TLC)和离子色谱(HPAEC)的方法鉴定该菌株所产普鲁兰酶为I型普鲁兰酶(见图5、图6)。该I型普鲁兰酶的酶促反应温度可以是40°C -70°C, 最适温度为60 °C ;酶促反应pH可以是pH5-9，最适pH值为6. 0，在pH 6. O 9. O范围内相对酶活力均大于90% ;60 °C处理50 min，酶活力残留约50%。该普鲁兰酶对马铃薯淀粉的降解能力约为其水解普鲁兰多糖的20%。本发明提供的I型普鲁兰酶可应用于淀粉加工、 环保、食品、医疗保健等行业。
图I :产普鲁兰酶菌株As的16S rDNA系统发育分析图。根据细菌16S rDNA分类标准，16S rDNA序列相似度大于等于99%可初步认为是同一种细菌。通过PCR扩增Jerofflmas sp. As菌株基因组16S rDNA序列，获得的序列与GenBank数据库中已知的微生物16S rDNA序列进行同源性比对,结果表明其与Jerofflmas/w/flciaia菌种相似度为99%。在系统发育树中与气单胞菌属菌株16S rDNA序列形成同一个簇,共与Aeromonaspunctata菌种具有最闻的相似度。图2 :产酶菌株Jeroffioaas 5/7. As菌落形态及显微形态图。该菌株显微形态为短杆菌；在LB平板上菌落粘稠容易长成菌苔，菌落圆形，微白色透明，边缘光滑，菌落中间凸起。该菌落形态与显微形态的特征与气单胞菌属细菌形态特征相符合。图3 :发酵时间对Jerofflmas sp. As产普鲁兰酶的影响。通过对Jerofflmas sp. As菌株发酵条件的优化(pH为7. 5，培养温度为30 °C)，选择不同的培养时间测定发酵上清液酶活。图中的结果表明培养48 h时，其产酶量最高，上清液普鲁兰酶活达到24. 8 U/mL, 通过蛋白浓度测定计算该发酵液的粗酶比活力约为40 U/mg。图4 : SDS-PAGE分析Aeromonas sp. As发酵上清液普鲁兰酶的纯化结果。 Aeromonas sp. As在不含淀粉的LB培养基发酵48 h后，其上清液存在大小约60 KDa,50 KDa和38 KDa的蛋白条带(泳道2)，通过对发酵上清液的酶活测定，发现其不具有普鲁兰酶酶活。使用含淀粉的发酵培养基摇瓶培养As菌株24 h后，除了上述3条主要的蛋白外，还在140 KDa处检测一蛋白表达条带(泳道3);发酵48 h后，140 KDa处的蛋白条带加深，测得发酵液中普鲁兰酶的酶活力提高(泳道4)。随后采取超滤的方法对粗酶液进行初步两步纯化，分别使用截留分子量为30 KDa (泳道5)和50 KDa (泳道6)的Amicon超滤管对发酵上清液进行浓缩截流。两步纯化后140 KDa蛋白条带明显变浓，蛋白比酶活进一步提高。 结果提示140 KDa的条带蛋白可能是Jerofflmas sp. As所产普鲁兰酶。戰b -Aeromonas sp· As所产普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物薄层层析分析图。根据 IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology)建立的两类分类标准(把普鲁兰降解酶分成多类，其中I型普鲁兰酶(Type I pullulanase, EC 3. 2. I. 41)专一水解普鲁兰糖α -1，6糖苷键产生麦芽三糖；新普鲁兰酶(Neopullulanase， EC3. 2. I. 135)专一水解普鲁兰多糖的α _1，4糖苷键产生潘糖。不同类型的普鲁兰降解酶能够水解不同的糖苷键，并生成不同的产物，因此在各个行业中的应用也不尽相同；而I型普鲁兰酶在工业上的应用最为广泛。本发明通过薄层层析(TLC)和离子色谱法(HPAECjn 图5)对As菌株所产普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物进行了分析。图中泳道I为葡萄糖 (Cl)、麦芽糖(C2)、麦芽三糖(C3)层析后位置；泳道2为未水解的普鲁兰多糖；泳道3是使 M Aeromonas sp. As菌株产生的普鲁兰酶水解普鲁兰多糖后得到的产物。该图表明As菌株普鲁兰酶水解普鲁兰多糖得到的产物为三糖。图6 deroffioftas sp. As产生的普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物离子色谱分析图。 为了进一步鉴定该普鲁兰降解酶的催化分类，本发明采取离子色谱的方法对其水解普鲁兰多糖的产物进行了鉴定。该普鲁兰降解酶水解普鲁兰多糖产生的三糖产物，其离子色谱保留时间约为16 min (如图A),与麦芽三糖的标准品的保留时间一致(如图B)。通过标准加入法分析，结果表明该酶水解普鲁兰糖三糖产物的色谱峰与麦芽三糖标准品的峰发生重叠 (见图C)，形成单一峰，这一结果说明该普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物是麦芽三糖，因此 As菌株所产普鲁兰酶属于I型普鲁兰酶。戰].Aeromonas sp· As产生的普鲁兰酶最适反应温度测定图。将5 μ L初步纯化后的粗酶液与95 μ L含1%普鲁兰多糖的20 mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中(pH 6.0) 混匀，分别在30，40，50，60，70和80 °C温度下反应10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图7的结果表明该普鲁兰酶可以在40-70°C进行酶促反应，酶活力在40%以上，最适反应温度为60 V。戰8 .Aeromonas sp· As产生的普鲁兰酶的最适pH测定图。分别配制含1%普鲁兰多糖的pH 4. O 10. O的缓冲液，其中pH 4. O 6. O为20 mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7. O 为 20 mM 的 NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液，pH 8. O 10. O 为 20mM 的 Tris-HCl 缓冲液。取含有底物的缓冲液95 μ L与5 μ L纯化后的酶液一起在水浴中60 °C反应10 min。 测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图7表明，在pH 6. O 9. O的范围内酶活均在90%以上，pH 5. O 9. O酶活都在70%以上，该酶的最适pH为6. O。图9 iAaromonas sp. As产生的普鲁兰酶的热稳定性测定图。将适量的酶液放置在60 °C、和65 °C下恒温水浴中，每隔10 min取样测定剩余酶活力，以保温O min时的酶活力计为100%。图8的结果表明，在60 °C条件下处理50 min，该普鲁兰酶的酶活力残留约 50%。图10 iAaromonas sp. As产生的普鲁兰酶的底物特异性测定。用20 mM朽1檬酸-朽1 檬酸三钠缓冲液(pH 6. 0)配制1%的普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、α -环糊精、β -环糊精溶液，取5 μ L酶液与95 μ L底物混合，于60 V反应10 min,用DNS还原糖法测定菌株As所产普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。图10的结果表明Jeroffioaas sp. As产生的普鲁兰酶水解淀粉的能力约为水解普鲁兰多糖的20%,不能水解直链淀粉(由α -1，4糖苷键构成)、α-环糊精和环糊精。
具体实施例方式所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》 (J. Sambrook, et al.,第二版，1996)
I.菌株，载体大肠杆菌菌株ToplO，质粒pPMD18-T均为本实验室保存，与现有文献中相应物质的性质相同。2.培养基
LB 培养基1.0% Polypeptone (BBI),O. 5% Yeast Extract (Oxoid),O. 5% NaCl, pH
7.O。平板富集培养基普鲁兰多糖3. O g，(NH4) 2 SO4 5. O g，KH2 PO4 O. 5g，MgSO4
7H20 O. I g，琼脂糖 20. O g，加水至 1000 mL，pH 值 5.0。菌种分离培养基蛋白胨10. 0 g，牛肉膏3. O g, NaCl 5 g，加水至1000 mL，pH值 6· O。产酶种子培养基可溶性淀粉I. 2 %，蛋白胨O. 8 %，酵母粉O. 2 %，MgSO4 · 7Η20
O.05 %，KH2 PO4 O. I %，pH 7· O。产酶发酵培养基可溶性淀粉I. 5 %，蛋白胨I. O %，酵母粉O. 5 %，MgSO4 · 7Η20
O.05 %，KH2 PO4 O. I %，pH 7· O。3.实验试剂普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉等多糖购于Sigma公司；分子生物学需要的试剂购自TaKaRa公司；引物合成和DNA测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。DNS (3，5-二硝基水杨酸)试剂(甲液溶解6. 9 g结晶酚于15. 2 mL 10%Na0H中，用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6. 9 g NaHSO3 ;乙液255克酒石酸钾钠加至300 mL 10%Na0H 中，再加入880 mL 1%3，5- 二硝基水杨酸溶液；将甲液与乙液相混合即得到黄色DNS试剂， 储于棕色瓶中，在室温下放置7 10天后使用)。4.普鲁兰酶酶活力测定方法本发明使用DNS还原糖法测定普鲁兰酶的酶活力。 具体方法如下取5 μ L酶液加入95 μ L含1% (质量体积比)的普鲁兰多糖的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中(pH 6.0,20 mM)，60°C反应10 min，加入100 μ L DNS终止反应，煮沸10 min显色；以5 μ L煮沸灭活的酶液为空白对照，570 nm测定吸光值，根据标准曲线计算产生还原糖的量，每组反应做3个平行样品。酶活单位定义每分钟释放I ymol还原糖(以葡萄糖计)定义为一个酶活力单位(IU)。实施例I :产普鲁兰酶菌株的筛选、分离及鉴定
取10 g 土样加入到装有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡30 min，使样品充分打散后，吸取100 μ L培养液稀释后涂布于以普鲁兰多糖为唯一碳源的平板富集培养基上， 30 °C温箱中培养48 h。从富集培养基上挑取不同形态单菌落各2个接于菌株分离培养基上，并对挑取的单菌落进行反复划线培养。随后，将平板划线纯化后的菌落接入产酶种子培养基中，30 1振荡培养24 h后，制得菌悬液。将菌悬液以4%接种量接入产酶发酵培养基， 30 1振荡培养48 h ;取出上清液加入含1%的普鲁兰多糖的柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0),37 °C反应30 min，初步测定发酵液上清中普鲁兰降解酶的酶活。对具有普鲁兰糖降解活性的菌株进行基因组抽提，PCR扩增16S rDNA。扩增序列为 16S rDNA 通用引物 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。 得到的 As 菌株 16S rDNA 序列(SEQ ID NO I)，在 RDP 数据库(http: //rdp. cme. msu. edu/)中进行分类。结果筛选获得产普鲁兰酶菌株As，经16S rDNA系统发育树分析、菌落形态、显微形态分析(见图I，图2)表明该菌株属于气单胞菌属sp.)。本发明为首次通过实验的方法从气单胞菌属中筛选获得普鲁兰酶菌株。实施例2 -Aeromonas sp. As发酵条件优化
As菌株的普鲁兰酶属于诱导型酶，需要在底物诱导条件下表达，因此在优化As菌株产普鲁兰酶条件时，采用可溶性淀粉作为产酶诱导物。对As菌株进行分离纯化后，挑取单菌落接种于装有25 mL种子培养基中，30 °C，震荡培养16 18 h;随后取2 mL转接入装有50 mL发酵培养基中，30 1震荡培养48 h，取上清测定酶活力。调整发酵培养基pH值(pH6. 5 和pH7. 5)和发酵温度(30 1和37 °C)，每隔12 h测定发酵液中普鲁兰酶酶活力，建立菌株As高产普鲁兰酶条件。实施例3 derofflmas 5/7. As发酵上清液中普鲁兰酶的初步纯化
Aeromonas sp. As菌株经发酵培养48 h后，取20 μ L发酵上清液使用12%的SDS-PAGE 检测蛋白表达条带。取30 mL发酵上清液，用Amicon超滤管(分子量30 KDa)超滤浓缩至I mL，缓冲液为20 mM Tris-HCKpH 8. 0)，取20 μ L进行SDS-PAGE检测，同时检测第I次超滤后的普鲁兰酶比酶活(U/mg蛋白)。第2次超滤纯化选用截留分子量为50 KDa的Amicon 超滤管，20 mM Tris-HCKpH 8. 0)，超滤后的终体积为800 μ L，取出20 μ L进行SDS-PAGE 检测(如图4)，同时测定普鲁兰酶的比酶活。实施例4 -.Aeromonas sp. As菌株产普鲁兰酶的酶学分类分析
由于不同类型的普鲁兰酶的应用不相同；其中，I型普鲁兰酶在工业上的应用最广。为了鉴定Aeromonas sp. As菌株产普鲁兰酶的酶学分类，本发明使用TLC和HPAEC方法对As 菌株普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物进行分析，具体操作如下
取5 μ L初步纯化后的酶液加入到95 μ L的底物(含1%普鲁兰多糖的20 mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 6.0)，60°C反应3 h，取2 3μ L水解后样品点样于Silica gel 60 F254板上，吹干后将硅胶板放置在丁醇/乙醇/水(5:3:2)展层液中展2 3次。展层结束后，在硅胶板上喷上甲醇/浓硫酸(7:3)显色液，于110°C烘干显色5 min。将上述酶解液稀释2000倍，取I mL上样色谱柱，使用Dionex 600离子色谱分析系统检测酶解液的组成，稀释2000倍的1%的麦芽三糖作为标准品。HPAEC洗脱条件在100 mM NaOH中以O 250 mM醋酸钠梯度洗脱30 min,流速为I mL/min。实施例5 -Aeromonas sp. As菌株产普鲁兰酶的酶学特性分析
(I)最适反应温度测定将5 μ L纯化后的酶液与95 μ L含1%普鲁兰多糖的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中(20 mM, pH 8.0)混匀，分别在30，40，50，60，70和80 °C温度下反应10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100% (如图7)。(2)最适pH值测定分别配制含1%普鲁兰糖的pH 3. O 10. O的缓冲液，其中pH
4.O 6. O为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7. O为20mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液， pH 8. O 10. O为20mM的Tris-HCl缓冲液。取含有底物的缓冲液95 μ L与5 μ L纯化后的酶液一起在水浴中60°C反应10 min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%(如图8)。(3)热稳定性分析将适量的酶液放置在60°C和65°C下恒温水浴中，每隔10 min 取样测定剩余酶活力，以保温O min时的酶活力计为100% (如图9)。
(4)底物特异性分析用20 mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH 6. O)配制1%的普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、α -环糊精、β -环糊精溶液，取5 μ L酶液与95 μ L底物 60 °C反应10 min，用DNS还原糖法测定菌株As所产普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。可见，本发明提供的I型普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。
权利要求
1.一株气单胞菌属菌株，其特征在于能够产生普鲁兰酶，菌种保藏号为CGMCC NO. 5490,命名为 iAeromonas sp. As。
2.如权利要求I所述的气单胞菌属菌株，其摇瓶发酵产生的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶， 其酶活为24. 8 U/mL。
3.用权利要求I所述气单胞菌属菌株产普鲁兰酶的方法，其特征在于具体步骤如下 对As菌株进行分离纯化后，挑取单菌落接种于15-25 mL种子培养基中，28-32 °C，震荡培养16 18 h;随后取1-2 mL转接入25-50 mL发酵培养基中，28-32 1震荡培养36-60 h ;其中，所述种子培养基组分为可溶性淀粉1_2%，蛋白胨O. 5-1. O %，酵母粉O. 1-0. 3 %， MgSO4 · 7H20 O. 02- O. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余为水，pH 6. 5-7. 5 ;所述发酵培养基组分为可溶性淀粉 1-2 %，蛋白胨 O. 5-1. 5 %，酵母粉 O. 5-1. O %，MgSO4 · 7H20 O. 02-0. 05 %，KH2 PO4 O. 05-0. I %，其余为水；pH 6. 5-7. 5。
4.如权利要求2所述的I型普鲁兰酶在淀粉加工、环保、食品或医疗保健行业中的应用。
全文摘要
本发明属于生物酶技术领域，具体为一种普鲁兰酶及其产酶菌株和应用。该普鲁兰酶来源于细菌中的气单胞菌属；该菌株所产普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够专一水解普鲁兰多糖或淀粉中的α-1，6葡萄糖糖苷键。在1.5%可溶性淀粉为底物诱导条件下表达；培养基pH7.5，培养温度30℃条件下，摇瓶发酵48h产普鲁兰酶的水平达到24.8U/mL。该菌株所产普鲁兰酶的最适反应温度为60℃；最适pH为6.0，在pH6.0～9.0范围内相对酶活大于90%；在60℃处理50min，该普鲁兰酶的残余活性达到了50%左右。本发明提供的I型普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。
文档编号C12N1/20GK102604861SQ20121003454
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者冯碧薇, 吕红, 周峻岗, 王儒恺 申请人:复旦大学