一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法，选择多粘芽孢杆菌（ paenibacilluspolymyxa ）CFCC10334作为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因 Npu 定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。提高了酶的稳定性、活性，降低了生产成本。
【专利说明】一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵 生产新普鲁兰酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程【技术领域】，具体涉及利用基因工程技术重组微生物新普鲁兰酶 基因，构建基因工程菌，通过重组酶在载体中的表达进行新普鲁兰酶的发酵生产。
【背景技术】
[0002] 新普鲁兰酶（Neopullulanase，/?/?/, EC3. 2 . 1. 135)属于葡萄糖苷水解酶类 (Glycosyl hydrolase family)的 α -淀粉水解酶族 13 ( a-amylase family 13)中的一 种，它是一个多功能复合型的淀粉水解酶，能催化淀粉的四种反应：水解α-(1 - 4)糖苷 键、水解α - (1 - 6)糖苷键、α - (1 - 4)键的转糖苷作用、α - (1 - 6)键的转糖苷作用。 因此，新普鲁兰酶既具有普鲁兰酶（pullulanase，PU，EC3. 2. 1.41)的活性，可将普鲁兰的 α - (1 - 6)糖苷键断开，生成麦芽三糖；又具有α -淀粉酶的活性，可将普鲁兰水解生成潘 糖。另外，在高糖浓度下，新普鲁兰酶还具有转α-(1 - 4)和α-(1 - 6)糖苷作用，可将 葡萄糖苷的分枝连接方式在α -(1 - 4)和α -(1 - 6)中相互转换。并且新普鲁兰酶是最 早发现的具有代表性的一类多功能淀粉酶（multifunctional amylase, MFA)。
[0003] 在自然界中，每种植物都能利用光合作用合成淀粉并将之存贮起来，为人类和动 物提供源源不断的能量。作为最原始的贮存能源，淀粉是很重要的多糖，在食品、饮料工业 中是必不可少的原材料。在淀粉生产淀粉糖的过程中特别是在糖化过程中辅助性的加入 新普鲁兰酶，能水解普通淀粉酶不能作用的a -(1 - 6)糖苷键，可提高淀粉糖的转化率。在 以淀粉生产酒精的工艺中，添加新普鲁兰酶可将淀粉的利用率提高3%_5% ;在以淀粉为原 料生产低聚异麦芽糖、低聚麦芽糖和低聚果糖、甘露寡糖等的生产过程中用新普鲁兰酶替 代其它转糖苷酶，可将低聚糖的转化率由原来的45%提高到60%左右，由于新普鲁兰酶能参 与淀粉水解的四种反应，所以在淀粉加工业中有着重要的用途。
[0004] 微生物是新普鲁兰酶的最佳来源，但由于天然菌种的产酶量低，直接用其生产出 的新普鲁兰酶成本较高，从而影响了新普鲁兰酶的推广应用。随着现代分子生物学的飞速 发展，采用基因工程技术手段改造产新普鲁兰酶微生物，构建新普鲁兰酶基因工程菌，提高 酶产量，进而进行大规模的发酵生产，己成为世界研究的热点。
[0005] 迄今为止，国内外研究的最详细的新普鲁兰酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆 菌 TRS40 (ifeciBws TRS40)的 NPL 和来源于普通高温放线 菌（极6?/--0<3<^//70〃?_7<^?>5 1^/§3/^>5 1?247)的1'\^11。除此之外，分别从海洋超适温菌 (TPAot/o 紐ri/ws)，嗜喊性芽抱杆菌 ifeciBiAs)，多粘芽抱杆菌 (ZfeciBw1S 环脂酸芽抱杆菌属 acii/oca/i/ariiAs)中发 现了新普鲁兰酶的存在。Takata等于1992年发现来源于嗜热脂肪芽胞杆菌（ZfeciBm siearoiAerffio/Ai/iAs TRS40)中的新普鲁兰酶（neopullulanase，NPase) (EC 3·2· 1. 135) 兼有糖苷水解酶和糖基转移酶催化活性，并且嗜热脂肪芽胞杆菌分泌的新普鲁兰酶是研究 最完善的一种，其酶的基因名为分类编号1422 [NCBI]，氨基酸序列长度为588个氨 基酸。酶的底物结合位点和催化活性中心均已确定，它的三级结构分析显示为二聚体。最 适温度为60?65°C，最适pH6. 0,分子量约为62ku。
[0006] 目前，虽有对嗜热芽孢杆菌中的新普鲁兰酶研究较为深入，但对来源于多粘芽孢 杆菌的研究相对较少，且尚未实现产业化。由于多粘芽孢杆菌属于原核生物，通常都会首先 利用大肠杆菌表达系统这一成熟的表达体系，进行多粘芽孢杆菌新普鲁兰酶的表达研究。 大肠杆菌表达系统是最简单的一种异源表达系统，它的优点是遗传背景比较清楚，表达水 平较高、易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因； 本发明的另一个目的在于提供一种用新普鲁兰酶基因通过克隆转化，在大肠杆菌中进 行诱导表达，发酵生产新普鲁兰酶的方法。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1。
[0009] -种重组表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。
[0010] 一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。
[0011] 上述的宿主细胞为含有上述的表达载体的原核细胞。
[0012] 一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆表达进行发酵生产新普鲁兰酶的方法， 包括如下步骤：选择多粘芽孢杆菌CFCC10334作为出发菌株， 基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4T-1的物理图谱，将 多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因你《定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达 产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行 诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进 行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。
[0013] 本发明中出发菌株的宿主菌是大肠杆菌BL21 (购自TaKaRa大连宝生物公 司），采用的出发菌菌种购于中国林业微生物菌种保藏管理中心保藏的多粘芽孢杆菌 保藏编号为CFCC10334。该菌种易得、安全性高、且培养方便， 其基因组DNA也易于提取。由于多粘芽孢杆菌属于原核生物，所以本发明选择利用大肠杆 菌表达系统这一成熟的表达体系，进行多粘芽孢杆菌新普鲁兰酶的表达研究。大肠杆菌表 达系统是最简单的一种异源表达系统，它的优点是遗传背景比较清楚，表达水平较高、易操 作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择。
[0014] 多粘类芽抱杆菌是芽抱杆菌科(Bacillaceae)类芽 孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，在划入类芽胞杆菌属之前又称 贝7忍。多粘类芽孢杆菌的细胞呈直杆状，（0· 5?2· 5) μ mX (1. 2?10· 0) μ m，G+C含量为 409Γ50%;利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆形芽孢；最适生长pH为7,最适温 度为28~30°C ;兼性厌氧，分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色 素，对人或动植物没有致病性，可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝剂等多种 生物活性物质，兼有生物农药和生物菌肥的作用，已广泛应用于农业、工矿业及废水处理等 领域。美国环境保护署（EPA)已将其列为可在商业上应用的微生物种类之一，我国农业部 也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。
[0015] 本发明中新普鲁兰酶基因的来源是多粘芽孢杆菌/?〇心 CFCC10334)，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4Τ-1的 物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因你《定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆 菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性。此外，根据表达载体上所带的标签蛋 白，融合表达产物可采用标签柱进行纯化，同时还可能增加融合蛋白的稳定性。具体方 案是对于多粘芽孢杆菌中获取的新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，最后在大肠杆菌中进行 诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到了一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后 进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。
[0016] 本发明采用基因工程技术，构建新普鲁兰酶基因工程菌，即从产新普鲁兰酶的多 粘芽孢杆菌中获取新普鲁兰酶基因，构建基因工程菌，通过重组酶在载体中的表达进行新 普鲁兰酶的发酵生产，提高了酶的稳定性、活性，降低了生产成本。
[0017] 本发明方法是发酵生产新普鲁兰酶的方法，菌种易得、安全性高、且培养方便，其 基因组DNA也易于提取。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为提取的细菌总DNA琼脂糖凝胶电泳结果图； 图2为多粘芽孢杆菌PCR克隆新普鲁兰酶基因片段图； 图3为新普鲁兰酶基因克隆转化大肠杆菌DH5 α阳性克隆图； 图4为多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因克隆子PCR鉴定图； 图5为表达引物PCR目的基因片段图； 图6为载体PGEX 4Τ-1与PCR产物图； 图7为重组新普鲁兰酶基因阳性转化子PCR鉴定图； 图8为GST-Npu基因在大肠杆菌BL21中的表达图； 图9为潘糖含量标准曲线图； 图10为基因工程菌遗传稳定性图； 图11为目的蛋白的SDS-PAGE图； 图12为纯化后的酶液于25°C保存6个月的酶活性图； 图13为纯化后的酶液于4°C保存12个月的酶活性图。
【具体实施方式】
[0019] 下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0020] 以下实施例所用材料，未指明的均为商购现有材料。
[0021] 实施例1 : (一）多粘芽孢杆菌基因组DNA的提取： 将多粘芽孢杆菌在营养肉汤培养基中于30°C恒温恒湿培养箱中培养过夜，取0. 5~2mL 培养菌液(最多不超过2 X IO9个细胞)，IOOOOrpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
[0022] 依照细菌DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒）方法提取该菌株的基因组DNA。
[0023] 按照如下操作步骤进行： (1) 加入200μ1缓冲液RB重悬细胞，IOOOrpm离心30秒，弃上清，将细胞震荡或吹打 重悬于180 μ 1缓冲液RB (革兰氏阴性菌）或者480 μ I 50mMNa2EDTA (ρΗ8· 0)(革兰氏阳 性菌）； (2) 加入 120μ1 溶菌酶（20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混匀。37°C温育30-60 分钟。12000rpm离心2分钟，弃上清后将细胞震荡或吹打重悬于180 μ 1缓冲液RB中； (3) 加入20 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200 μ 1结合液CB，在涡旋 振荡器上高速连续振荡混匀25秒。在70°C放置10分钟； (4) 冷却后加入100 μ 1异丙醇，涡旋振荡混匀，此时可能会出现絮状沉淀； (5) 将上一步混合物(包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管 中），13000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液； (6) 加入500 μ 1抑制物去除液IR, 12000rpm离心30秒，弃废液； (7) 加入500 μ 1漂洗液WB (其中加入了无水乙醇)，于12000rpm离心30秒，弃废液； (8) 加入500 μ 1漂洗液WB，于12000rpm离心30秒，弃废液； (9) 将吸附柱AC放回空收集管中，于13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗 液中残留的乙醇抑制下游反应； (10) 取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100 μ 1洗脱缓 冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，于12000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，于12000rpm离心1 分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA的浓度高，可以适当减少洗脱体积，不少 于50 μ 1，过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量； (11) DNA可以存放在2-8°C环境下，如果要长时间存放，可以放在零下20°C环境下。
[0024] 提取的细菌总DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，图中可看到明显的DNA条带。
[0025] (二）DNA 纯度检测： 取2〇μ L基因组DNA样品，加灭菌水稀释，用紫外分光光度计测定λ =260nm和λ =280 nm的吸光度值，计算0D260/0D280的比值。一般认为0D260/0D280〈1.8表示样品中有蛋白 质、多糖或多酚污染；0D260/0D280>1.9表示RNA含量过多；0D260/0D280=1.8?1. 9,则DNA 纯度比较高。
[0026](三）引物的设计与合成： 利用Primer premier 5.0软件，根据已报道的多粘芽孢杆菌中编码新普鲁兰酶基因 序列（U89716. 1)针对该基因开放阅读框（ORF)上游、下游保守序列设计特异引物。引物由 Invitrogen公司合成。表达时选取BamH I和Not I作为酶切位点。
[0027] 根据方法所述，分别设计新普鲁兰酶基因克隆引物，如下所示：
【权利要求】
1. 一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1。
2. -种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3. -种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求1所述的核苷酸序列的 原核细胞。
4. 如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求2所述 的表达载体的原核细胞。
5. -种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆表达进行发酵生产新普鲁兰酶的方法， 其特征在于它包括如下步骤：选择多粘芽孢杆菌JrJrO1S CFCC10334作 为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4T-1的 物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因層7?定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆 菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大 肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工 程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。
【文档编号】C12N9/44GK104313042SQ201410544086
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】胡先望, 杜建泉, 梁宁, 陈朋, 严晓娟, 宋勇强, 张鸣明 申请人:甘肃省商业科技研究所