专利名称：：桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及桃胶多糖的制备领域，具体涉及一种桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用。
背景技术：
：阿拉伯胶替代品的研究开发和生产是非常迫切而必要的，代替阿拉伯胶的新产品可以对稳定市场供应进行有效控制。桃胶是替代阿拉伯树胶的唯一天然植物胶粘剂。桃、李、杏、樱桃等树干分泌的胶称为桃胶。桃胶是半透明的多糖物质，用途广泛，可被用于食品、医药、化妆、印刷、纤维等轻、化工领域，如纺织工业用作酸性印花浆料，花筒雕刻工艺用作保护胶剂，印刷工业用作金粉胶粘剂等。桃胶在我国的工业化生产还刚起步，国内有些生产桃胶的厂家，但大部分都属于酸碱法制造粗制桃胶，该方法是将原桃胶用水浸胀后，通过酸、碱和高温的方法水解成水溶性桃胶，桃胶多糖高温化学水解过程发生褐变反应会导致产品色泽变暗，在后续工序还要进行漂白脱色，在水解工序，浸提酸度大，加热时间过长都会导致胶质彻底水解成单糖，降低提取率，浸提碱性太强，会对生产设备造成影响，另外，采用酸碱水解法生产工艺还会产生大量酸碱废水，造成一定的环保负担。在国内外，桃胶多糖产品已作为商品出售，占有可观的市场份额并展现很大的市场潜力，目前市场对桃胶的需求越来越大，对产品质量要求也很高。但对桃胶产品性质及生产研究报道并不多。利用酶法生产桃胶多糖，是可以获得高质量、相对分子量范围较窄桃胶产品的一种有效生产技术。酶法生产是以酶为催化剂，具有高效、安全、生态和环保等特点，能够有效带动相关领域技术水平的提高，对应用产业开发新产品、提高质量、节能降耗、保护环境具有重要意义。找到一种高效低成本的桃胶生产用酶是制约桃胶生产的瓶颈。但目前尚未见到利用微生物发酵法生产桃胶分解用酶，从而进行桃胶多糖生产的相关报道。
发明内容本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种可生产桃胶分解复合酶的菌株，且该桃胶分解复合酶对桃胶具有较强的分解能力。本发明的另一个目的是提供上述菌株生产的桃胶分解酶，用于桃胶多糖中的制备。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明人分离筛选到一株新的对大分子原桃胶具有分解能力的菌株，该菌株属于微杆菌，名称为微杆菌A5(英文名为Microbacteriumsp.A5)，已于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCN0:M209174。—、菌株的分离本发明人发现卡拉胶由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3，6-脱水半乳糖通过a-l，3糖苷键和P-l，4键交替连接而成，在1，3连接的D半乳糖单位C4上带有l个硫酸基，很难被微生物分解；桃胶主要含有半乳糖，阿拉伯糖，木糖，糖醛酸，分子结构未知，半乳糖与糖醛酸含量与卡拉胶接近，因此本发明人筛选能分解卡拉胶的菌株，将该菌株用于降解桃胶。1.能分解卡拉胶菌株的筛选卡拉胶作为一种海产多糖，很少为陆地微生物所降解。但是在生产卡拉胶的工厂之中，发明人取得了卡拉胶自然变质的样品，白色粉末状的卡拉胶变质成为棕色的胶泥样固体。以该变质的卡拉胶作为原料，先筛选降解卡拉胶的菌株，其步骤如下(1)采用稀释涂平板法对变质卡拉胶进行微生物分离，样品稀释度为10—2、10—3、10—4和10—5，分别涂布营养琼脂培养基平板和麦芽汁培养基平板上，每个浓度3个平板，好氧与厌氧培养后进行菌落分离；(2)将分离到的12个疑似菌种接入甲基红卡拉胶培养基(培养基组成甲基红0.lg、卡拉胶40g、营养肉汤10g，蒸馏水定容至1L)中培养，若该菌株可以分解卡拉胶使硫酸解离，则接种该菌种的培养基变红；接着本发明人依次采用菌株对卡拉胶分解试验、菌株对原桃胶分解试验，筛选出对桃胶具有分解能力的菌株，其步骤如下2.菌株对卡拉胶分解实验选取上述步骤(2)中，红色最明显的菌扩增(细菌使用营养肉汤，真菌使用液体真菌培养基)，将所得培养液50ml接入200ml不同浓度的纯卡拉胶培养基中，另接入无菌水作对照组，测量其粘度作为对比；若卡拉胶分解则粘度有明显降低；3.筛选菌株对原桃胶分解实验选取上述试验中对卡拉胶降解能力最强的细菌菌株，接入营养肉汤扩增，将所得培养液50ml接入200ml不同浓度的桃胶培养基中，另接入无菌水作对照组，测量其还原糖含量作为对比；如桃胶分解还原糖含量有明显升高；最后，对筛选到的对桃胶具有分解能力的菌株，进行产酶驯化试验，从而最终获得具有高效降解桃胶活性的菌株，其步骤如下4.菌种产酶驯化实验将上述试验中获得的对桃胶降解能力最强的菌株进行产酶驯化；第1次驯化方法分别取营养肉汤150ml、2X桃胶(质量百分比)、种子液化20mL、放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的荡箱中振荡培养七天；第2次驯化方法分别取营养肉汤150mL、4%(质量百分比)桃胶、第一次训化菌液20mL放入250mL锥形瓶中，在30°C、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养七天；第3次驯化方法分别取营养肉汤150mL、6%(质量百分比)桃胶、第二次驯化菌液20mL放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养至残糖降为1%;第4次驯化方法分别取营养肉汤150mL、第3次驯化过的菌液20ml、8X(质量百分比)桃胶放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养至残糖降为1%;经过四次驯化，最终获得对桃胶分解力较强的菌株。二、菌种鉴定对上述筛选获得的桃胶分解力较强的菌株进行鉴定。1.分子生物学鉴定对上述筛选所得对桃胶分解力较强的菌株，进行分子生物学鉴定，根据16SrDNA测序分子鉴定、细菌形态观察和生理生化实验，结果显示该菌株与微杆菌属(Microbacterium)同源性达99%以上，其形态特征及生理生化特征与微杆菌属(Microbacterium)最相符合。2.本发明人从国内微生物菌种保藏中心购买了其它四株微杆菌菌株与本发明筛选的菌株共同用于桃胶分解实验，本发明的菌株具有很强的桃胶分解能力，而其它四种菌株不具有桃胶分解能力。此外，国内外也未见有微杆菌菌株具有桃胶分解能力的相关报道。综上所述，本发明筛选获得了微杆菌属的一种新菌株，名称为微杆菌A5(英文名为Microbacteriumsp.A5)，该菌株可高产桃胶分解酶。三、菌种的培养条件本发明人经过试验研究发现，本发明的微杆菌A5其培养条件如下斜面培养采用含8%桃胶(质量百分比)的营养琼脂培养基，3(TC，培养36小时。液体培养采用含8%桃胶(质量百分比)的营养肉汤培养基，在3(TC、180r/min振荡培养24小时。本发明在菌种筛选以及菌种培养中所需要的培养基，如营养琼脂培养基、营养肉汤和麦芽汁培养基，均为本领域技术人员的常用培养基，其配方采用常规配方即可实现本发明。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明通过分离筛选获得一株新菌株，该菌株可高效生产桃胶分解酶，将该分解酶用于桃胶降解，即可得到富有经济价值的桃胶多糖；2.本发明采用酶法生产桃胶，其水解周期短，产品的相对分子质量分布较窄，无环境污染，容易控制；3.本发明提供一种新的、更环保、产品质量统一的生物法树胶生产工艺，利于社会的可持续性发展，同时也将促进我国农业栽培的废弃物深加工综合利用开发，具备很广阔的市场前景。图1为桃胶分解酶SDS-PAGE电泳图；其中，1为蛋白Marker,2为桃胶分解酶粗酶制剂，3为稀释后的桃胶分解酶粗酶制剂。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1菌株的筛选获得本实施例以变质的卡拉胶作为原料，先筛选得到能降解卡拉胶的菌株，然后通过卡拉胶降解能力以及原桃胶降解能力，两个筛选条件，挑选出对原桃胶具有降解能力的菌株，接着再结合菌种产酶驯化，从而最终获得可高效降解桃胶的菌株，其具体步骤如下1.能分解卡拉胶菌株的筛选(1)采用稀释涂平板法对变质卡拉胶进行微生物分离，样品稀释度为10—2、10—3、10—4和10—5，分别涂布营养琼脂培养基平板和麦芽汁培养基平板上，每个浓度3个平板，好氧与厌氧培养后进行菌落分离；(2)将分离到的12个疑似菌种接入甲基红卡拉胶培养基(培养基组成甲基红0.lg，卡拉胶40g，营养肉汤10g，蒸馏水定容至1L)中培养，若该菌株可以分解卡拉胶使硫酸解离，则接种该菌种的培养基变红；2.菌株对卡拉胶分解实验选取上述步骤(2)中，红色最明显的菌扩增(细菌使用营养肉汤，真菌使用液体真菌培养基)，将所得培养液50ml接入200ml不同浓度的纯卡拉胶培养基中，另接入无菌水作对照组，测量其粘度作为对比；若卡拉胶分解则粘度有明显降低；3.筛选菌株对原桃胶分解实验选取上述试验中对卡拉胶降解能力最强的细菌菌株，接入营养肉汤扩增，将所得培养液50ml接入200ml不同浓度的桃胶培养基中，另接入无菌水作对照组，测量其还原糖含量作为对比；如桃胶分解还原糖含量有明显升高；4.菌种产酶驯化实验将上述试验中获得的对桃胶降解能力最强的菌株进行产酶驯化；第1次驯化方法分别取营养肉汤150ml、2X桃胶(质量百分比)、种子液化20mL、放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的荡箱中振荡培养七天；第2次驯化方法分别取营养肉汤150mL、4X桃胶(质量百分比)、第一次训化菌液20mL放入250mL锥形瓶中，在30°C、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养七天；第3次驯化方法分别取营养肉汤150mL、6X桃胶(质量百分比)、第二次驯化菌液20mL放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养至残糖降为1%;第4次驯化方法分别取营养肉汤150mL、第3次驯化过的菌液20ml、8X桃胶(质量百分比)放入250mL锥形瓶中，在3(TC、振荡速度180r/min的振荡箱中振荡培养至残糖降为1%;经过四次驯化，最终获得对桃胶分解力较强的菌株。实施例2菌株的鉴定分析本实施例对实施例1筛选获得，对桃胶分解力较强的菌株进行鉴定。1.16SrDNA测序将该菌株提取DNA，采用核酸/蛋白质分析仪于NucleicAcid程序下测定，进行DNA纯度和浓度检测，进行PCR扩增，空白对照中含有除模板核酸外的所有组份。扩增产物送测序公司测序，将得到的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blastsearch)，结果发现该菌株与微杆菌属(Microbacterium)同源性达99%以上，其形态特征及生理生化特征与微杆菌属(Microbacterium)最相符合。2.生理生化实验实施例1筛选获得的对桃胶分解力较强的菌株，其菌落形态为黄色菌落，表面光滑不透明，边缘整齐有光泽；革兰氏染色结果阳性，有球杆变形现象，但无明显杆-球同期，厌氧实验结果是好氧生长，厌氧条件下不生长；接触酶实验阳性，氧化酶实验阴性，V-P实验阴性，明胶液化实验阳性，硝酸盐还原实验阴性，糖醇发酵实验葡萄糖、蔗糖和海藻糖阳性，蜜二糖阴性。查阅常见细菌系统鉴定手册和伯杰细菌鉴定手册知，可知实施例1筛选到的菌株属于微杆菌属，桃胶发酵实验结果阳性。目前已知的微杆菌属的菌种，均没有能降解桃胶的报道，因此实施例1筛选到的菌株有别于其它微杆菌株，说明本发明筛选获得了微杆菌属的一种新菌株，名称为微杆菌A5(英文名为Microbacteriumsp.A5)，该菌株可高产桃胶分解酶。实施例3菌株生产桃胶分解酶的性质鉴定1.桃胶多糖的测定1)标准曲线的绘制葡萄糖标准液的制备准确称取100mg葡萄糖，先用少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中定容，得1.OOmg/ml的标准葡萄糖溶液。准确取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50ml的1.OOmg/ml葡萄糖标准液分别加入到50ml的容量瓶中，各加5ml的DNS在沸水浴中煮5min后流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。在540nm的吸收光谱波长下测定光密度值。2)样品测定分别取各储备液1ml于50ml容量瓶中，其他步骤与标准曲线的制作相同，测出样品的光密度值，并根据标准曲线求出含量。2.菌种对桃胶降解能力通过测菌体生长过程中含桃胶培养基中还原糖增加的情况，间接反映对菌株产酶分解桃胶解离出还愿糖的能力。用含8%桃胶的培养基按5%接种量接入各液体菌种，301:，180rpm震荡培养48小时测定发酵液中还原糖含量，还原糖含量升高表明原桃胶被不同程度降解。对照组本发明人从国内微生物菌种保藏中心购买了四株已保存的微杆菌，作为对照菌。空白对照以不接种的含8%桃胶的培养基为空白对照。发酵液经四层纱布过滤，6(TC烘干至衡重称量未分解桃胶重量，与发酵前添加量相比，计算桃胶分解率，结果如表1所示。表1不同菌株降解桃胶释放还原糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从表1可以看出，作为对照的四株现有微杆菌，对桃胶分解率仅有0.1%，而本发明的微杆菌A5对桃胶分解率有95%，说明本发明的微杆菌A5是一种新的微杆菌菌种，而且具有高效降解桃胶的能力。3.发酵液中粗酶的提取发酵液经滤布过滤后5000rpm离心30分钟，得澄清的酶液，70%酒精沉淀，沉淀用加醋酸处理脱多糖，获得粗酶制剂。4.桃胶分解酶系分析将上述粗酶直接进行SDS-PAGE电泳分析，电泳结果如图1所示。从图中可以看出，微杆菌A5分泌的降解桃胶酶，是一种复合酶，由两种酶组成。实施例4微杆菌A5桃胶分解酶用于制备精致桃胶多糖将原桃胶进行清洗，去除树皮、泥土等杂质后，用清水进行浸泡，使其充分溶胀，加入实施例3中得到的，微杆菌A5生产的桃胶分解复合酶粗制剂，3(TC保温24小时，间歇搅拌使反应均匀。将反应后的溶液5000rpm离心30min，去上清，通过DEAE-纤维素分子筛收集不同分子量多糖溶液，从而得到纯净的分子量均一的桃胶多糖溶液。采用进风温度1S(TC，出风温度9(TC的喷雾干燥制得纯净的精制桃胶粉末。权利要求一种桃胶分解酶生产菌株，其特征在于该菌株于已于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNOM209174。2.权利要求1所述桃胶分解酶生产菌株的筛选方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)采用稀释涂平板法对变质卡拉胶进行微生物分离，筛选出可分解卡拉胶的菌株；(2)将步骤(1)筛选到的菌株，进行不同浓度卡拉胶的分解试验，筛选出卡拉胶分解力最强的菌株；(3)将步骤(2)筛选到的菌株，进行原桃胶分解试验，筛选出桃胶分解力最强的菌株；(4)将步骤(3)筛选到的菌株进行产酶驯化，驯化过程中，桃胶的含量逐渐增加，最后得到对桃胶分解力较强的菌株，该菌株即为本发明所需的桃胶分解酶生产菌株。3.权利要求1所述桃胶分解酶生产菌株在制备桃胶多糖中的应用。全文摘要本发明公开一种桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用，该桃胶分解酶生产菌株属于微杆菌，名称为微杆菌A5，已于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNOM209174。本发明的菌株可高效生产桃胶分解酶，将该分解酶用于原桃胶降解，即可得到富有经济价值的桃胶多糖。利用本发明的菌株，可采用酶法生产桃胶，其水解周期短，产品的相对分子质量分布较窄，无环境污染，容易控制。本发明提供一种新的、更环保、产品质量统一的生物法树胶生产工艺，利于社会的可持续性发展，同时也将促进我国农业栽培的废弃物深加工综合利用开发，具备很广阔的市场前景。文档编号C12Q1/04GK101701198SQ200910193340公开日2010年5月5日申请日期2009年10月27日优先权日2009年10月27日发明者冉艳红,戚彩娃,杨曼娜,陆俏颖申请人:暨南大学