大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用。本发明构建携带Ku70基因同源重组DNA片段的基因敲除载体，通过农杆菌介导的大丽轮枝菌的遗传转化，从大量的转化子中筛选获得一株缺失Ku70基因的ΔVdKu70缺陷突变体菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107。本发明获得的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株与野生型的形态特征和致病力基本一致，对UV处理更加敏感；采用本发明大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株作为背景菌株进行基因打靶，其打靶效率比野生型菌株提高了40％到60％。本发明为大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因等方面的研究提供了背景菌株。
CGMCC No.10107
20141202
【专利说明】大丽轮枝菌AVdKu70缺陷突变体菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌突变体菌株，尤其涉及大丽轮枝菌AVdKuTO缺陷突变体 菌株，本发明还涉及所述大丽轮枝菌AVdKuYO缺陷突变体菌株作为背景菌株在大丽轮枝 菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因的研宄等方面中的应用，属于大丽轮枝 菌突变体菌株的构建及应用领域。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)是一种真菌病害，寄主范围非常广泛，能 侵染棉花、番茄、亚麻、马铃薯、番茄、黄瓜、烟草、辣椒和茄子等两百多种经济作物，危害极 其严重且药剂难于防治，成为作物生产发展的瓶颈。随着大丽轮枝菌小种VdLs. 17基因 组序列的成功测序（klosterman S·，Subbarao K·，Kang S.et al. Comparative Genomics Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens. PLoS Pathogens, 2011，Vol. 7 (NO. 7))，并公布在了 Broad Institute上，对大丽轮枝菌致病基因 的研宄和入侵过程中的分子机理的研宄提供了有利的基因资源。然而，大丽轮枝菌入侵机 制的研宄还停留在初步阶段，病程相关基因的研宄甚少。因此，利用"反向基因组学"研宄 大丽轮枝菌的致病机制显得更加重要。采用"反向基因组学"研宄大丽轮枝菌致病基因的 功能，主要是通过基因打靶获得相关基因的突变体分析基因功能。
[0003] 真菌的基因打靶已有几十年的历史，目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还 比较困难，宄其原因是真菌体细胞内同源重组频率非常低下，远低于非同源末端连接（二 者比例为I :10000?1 :〇〇〇)，以至于外源基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连 接途径随机插入基因组中。
[0004] 大丽轮枝菌野生型菌株基因打靶效率非常低，很难实现基因的精确打靶，严重妨 碍了大丽轮枝菌入侵机制和与寄主共存机理的研宄。因此，获得大丽轮枝菌Ku基因的缺陷 突变体，有效提高大丽轮枝菌基因打靶效率成为亟待需要解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) AVdKu70缺陷突变体菌株，该突变体菌株能够显著提高基因打靶 的效率，实现靶基因的精确打靶，应用于大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关 键靶基因的研宄等方面。
[0006] 本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明首先公开了一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌AVdKu70缺陷突变体菌株。 本发明采用In-Fusion克隆技术构建Ku70基因的同源重组DNA片段并克隆至pGK02载体 上，构建基因敲除载体PGKO-Hyg-Ku70,转化农杆菌AGL-I，用于大丽轮枝菌的遗传转化。通 过同源重组和大量的转化子筛选，最终从205个转化子中筛选获得一株敲除了 Ku70基因的 大丽轮枝菌Δ VdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991 Δ Ku70-1。
[0008] 本发明将获得的敲除了 Ku70基因的大丽轮枝菌AVdKu70缺陷突变体菌株 Vd991 ΔΚιι70-1提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 10107 ;分 类命名为：大丽轮枝菌Verticillium dahliae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏时间是2014年12月02日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0009] 目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还比较困难，原因是真菌体细胞内同源 重组频率非常低下，远低于非同源末端连接（二者比例为I :10000?1 :〇〇〇)，以至于外源 基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组中；再考虑到对受 体细胞的转化率（通常1%?5% )，借助同源重组成功打靶只得依赖大量受体细胞的使 用，这导致前期转化和后期筛选繁重耗时，超出通常可承受范围，阻碍基因打靶（Krappmann S.Gene targeting in filamentous fungi: the benefits of impaired repair. The Mycologist，2007,（I) :25-29.)。近年来，农杆菌介导的遗传转化在大丽轮枝菌中的成功应 用，极大地提高了转化效率，为大丽轮枝菌的基因敲除奠定了基础。
[0010] 大丽轮枝菌基因敲除主要包括载体构建、农杆菌介导转化、转化子筛选和分子鉴 定4个步骤，其中转化子筛选是一个技术难点。借助同源重组成功的在野生型菌株中实 现基因打靶十分困难，因为打靶效率非常低，远远低于5%，比如：在米曲霉（Aspergillus so jae)和酱油曲霉（A. oryzae)中是 1 % (Takahashi T·，Masuda T·，Koyama Υ· Enhanced gene targeting frequency in ku70and ku80disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genet Genomics, 2006, 275:460-470.);在稻瘟病菌 中仅为1.18% (林春花，郑服丛.稻瘟菌MgORPl基因敲除突变株的构建及其表型分析.微 生物学报，2008, 48 (9) : 1160-1167.)。
[0011] 本发明结果表明，借助同源重组成功的在野生型大丽轮枝菌中实现基因打靶效率 更低，仅为〇. 48%。本发明共挑取到抗潮霉素的转化子205个，PCR检测仅有1个转化子没 有扩增到Ku70基因，本发明将该没有扩增到Ku70基因的转化子命名为Λ VdKu70Hyg。PCR检 测和Southern-blot杂交试验确定，在获得的Λ VdKu70Hyg转化菌株中，潮霉素的表达盒已 成功的整合并取代了 VdKu70基因，表明本发明成功获得一株敲除了 Ku70基因的大丽轮枝 菌AVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991 ΔΚιι70-1。
[0012] 表型特征分析结果表明，AVdku70缺陷突变体菌株Vd991AKu70-l在以蔗糖、木 糖、果胶质、半乳糖、淀粉为碳源的Czapek培养基上的生长能力与野生型基本一致，没有 显著的不同；其产孢能力与野生型相比也没有显著的变化，产孢量基本一致；但AVdKu70 突变体菌株Vd991 ΔΚιι70-1对UV处理更加敏感，经过UV照射的AVdku70缺陷突变体菌 株的存活孢子基本不存在。ΔΚιι70缺陷突变体菌株对UV照射变得更加敏感有可能的原 因是Ku70蛋白在真菌微生物中维持着丝粒长度起着重要的作用（Boulton S·，Jackson S.Identification of a Saccharomyces cerevisiae Ku80homologue:roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance. Nucleic Acids Research, 1996, 24:4639 - 4684.)，Δ Ku70缺陷菌株缺少Ku70蛋白导致DNAs修复机制受 到损伤而难以完成自身的修复，使其对UV照射变得更加敏感。
[0013] 致病力实验结果表明，Δ Vdku70缺陷突变体菌株Vd991 AKU70-1的致病力与野生 型比较没有显著的变化，接种相同浓度AVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株的孢子悬 浮液后的本生烟植株的感病症状基本一致；而AVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株感 病本生烟植株中真菌生物量也没有显著差异，都是在根中真菌的生物量最高，其次是在茎 中（根基部往上Icm处），在叶中的生物量最低。
[0014] 从形态学和致病力角度分析，本发明获得的大丽轮枝菌Δν(1Κιι70缺陷突变体菌 株Vd991 AKU70-1可作为基因打靶的背景菌株应用于基因打靶。
[0015] 本发明还公开了一种利用所述大丽轮枝菌Δ VdKu70缺陷突变体菌株 Vd991 AKU70-1进行基因打靶的方法，包括以下步骤：
[0016] (1)构建携带靶基因同源重组DNA片段的基因敲除载体，转化农杆菌；（2)利用农 杆菌介导法转化所述大丽轮枝菌Δν(1Κιι70缺陷突变体菌株；(3)筛选转化子，鉴定，即得。
[0017] 其中，步骤（1)采用In-Fusion克隆技术构建靶基因同源重组DNA片段。由于本 发明获得的AVdKu70缺陷突变体菌株Vd991AKu70-l已经具有潮霉素的抗性，因此，在构 建靶基因的同源重组DNA片段时选择其它抗性基因取代待敲除的靶基因，例如遗传霉素 (neomycin)抗性基因表达盒。
[0018] AVdKu70缺陷突变体菌株Vd991 ΔΚιι70-1的基因打靶效率评估实验结果表明，大 丽轮枝菌Λ VdKu70缺陷突变体菌株的基因打靶效率相比野生型提高了 40%到60%，显著 提高了基因打靶的效率，精确的实现了特定靶基因的改造。
[0019] 本发明获得的大丽轮枝菌AVdKu70缺陷突变体菌株能够应用于大丽轮枝菌的基 因打靶、研宄大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及研宄大丽轮枝菌病程关键基因的 功能等，为利用"反向基因组学"研宄大丽轮枝菌病程关键基因和侵染机制提供了一株高效 基因打靶的遗传背景菌株。
[0020] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0021] 本发明敲除了大丽轮枝菌非同源末端连接的主要蛋白一Ku70蛋白，获得 AVdKu70缺陷突变体菌株Vd991AKu70-l，其与野生型相比形态特征和致病力基本一致， 但对UV处理变得更加敏感，显著提高同源重组的频率，实现了靶基因的精确打靶，为大丽 轮枝菌病程机制的研宄等提供了一株高效的基因打靶菌株。
[0022] 本发明所涉及到的术语宙义
[0023] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0024] 术语"基因打靶"意指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从 而在生物活体内研宄此基因的功能。
[0025] 术语"同源重组"意指发生在非姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染 色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为VdKu70蛋白和其它已经获得Ku蛋白缺陷的突变体的真菌的Ku70蛋白的 系统进化树；
[0027] 图2为利用潮霉素抗性基因表达盒构建VdKu70敲除突变体；其中，A :通过同源重 组获得VdKu70敲除突变体的过程；B，C :PCR检测分析VdKu70敲除突变体；其中，B :是以 Hyg-J-F/Hyg-J-R引物检测，在野生型中没有获得潮霉素 I. 6kb的片段，在突变体菌株中获 得了 I. 6kb的片段；C :利用Ku70-J-F/Ku70-J-R引物检测，在野生型中获得I. 8kb的VdKu70 基因的片段，在突变体没有获得1.8kb的VdKu70基因的片段；D，E :分别用VdKu70基因的探 针（D)和Hyg基因的探针（E)杂交突变体和野生型的基因组经Kpn I酶切后Southern-blot 杂交检测；其中，Vd-wt为野生型菌株；Vd-AKu70为AVdKu70突变体菌株Vd991AKu70-l ;
[0028] 图3为转化子的筛选实验；其中，A :获得的转化子；B :转化子的PCR检测；
[0029] 图4为AVdKu70突变体和野生型菌株的形态学表型特征；其中，ΔΚιι70为 AVdKu70突变体菌株Vd991 ΔΚιι70-1 ;A-E : AVdKu70突变体相比较野生型在不同碳源上的 生长表型；A :果胶质，B :半乳糖，C :木糖，D :淀粉，E :蔗糖；F : Λ VdKu70突变体和野生型菌 株的产孢量比较；
[0030] 图5为Δ VdKu70突变体菌株的UV照射实验；其中，Δ Ku70为Δ VdKu70突变体菌 株 Vd991 ΔΚιι70-1 ;
[0031] 图6为AVdKu70突变体和野生型菌株侵染本生烟实验；其中，Vd-wt为野生型菌 株；VdAKu70为Δ VdKu70突变体菌株Vd991 ΔΚιι70-1 ;A :蘸根法接种Δ VdKu70突变体和 野生型菌株的本生烟病程曲线；B :本生烟植株被侵染12天以后，25ng的本生烟DNA中的大 丽轮枝菌DNA的实时定量分析。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033] 1、菌株和质粒
[0034] 大丽轮枝菌Vd991 (中国农业科学院植物保护研宄所简桂良惠赠）；
[0035] 根癌农杆菌AGL1、质粒pGK02、pUC-Hyg、pCAM_neo (中国农业科学院农产品加工研 宄所戴小楓惠赠）。
[0036] 2、培养基
[0037] LB用于大肠杆菌培养；YEB用于农杆菌液体培养；CM、PDA、Czapek培养基用于 大_轮枝菌的培养；MM 和 IM(Hooykaas P，Roobol C，Schilperoort R.Regulation of the transfer of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Microbiology,1979, 110(1) :99-109.)用于转化农杆菌的培养。
[0038] 实施例1大丽轮枝菌Δ VdKu70缺陷突变体的获得与鉴定
[0039] 1、实验方法
[0040] I. 1基因敲除质粒pGK0-Hyg-Ku70的构建
[0041] Ku70 基因的同源重组 DNA 片段构建米用 In-Fusion (Frandsen R.，Frandsen M, Giese H. Targeted gene replacement in fungal pathogens via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[M]//Plant Fungal Pathogens. Humana Press, 2012:17-45.)克隆技术。以质粒pUC-Hyg为模板，以Hyg-F/Hyg-R为引物（引物 名称和序列见表1)，扩增长度为I. 8kb的潮霉素抗性基因盒。以大丽轮枝菌基因组为模 板，分别以 Ku70-5F/Ku70-5R 和 Ku70-3F/Ku70-3R 为引物，引物 Ku70-5R/Ku70-3F 5' 端的 16bp含有与Hyg-F/R互为反向互补的接头，引物Ku70-5F/Ku70-3R 5'端的16bp含有与 pGK02(经EcoR I和Hind III线性化的片段）两段互为反向互补的接头，PCR扩增长度分 别为 0. 8kb 和 I. Ikb 的 Ku70 基因（VDAG_10247. IBroad Institute)上下游 DNA 片段，获得 末端含有相应互为反向互补序列的3个PCR产物。通过In-Fusion" HD Cloning Kit User Manual(Clontech，USA)将3个片段整合到pGK02载体上，构建载体pGK0-Hyg-Ku70。I. 2农 杆菌介导的大丽轮枝菌的转化
[0042] 电击法将基因敲除质粒pGK0-Hyg-Ku70转化到农杆菌AGL-I中，用于大 丽轮枝菌的遗传转化。转化方法参照Mullins等（Mullins E.，Chen X，Romaine P, et al.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopatholo gy, 2001，91 (2) : 173-180.)的方法进行。
[0043] I. 3转化子筛选
[0044] 挑取转化子，放在含有潮霉素抗性的PDA培养基中再次筛选培养。将生长出的转 化子转入液体CM中培养震荡7d (25°C，200r/min)，收集菌丝，提取总基因组DNA。使用引物 Ku70-J-F/Ku70-J-R 进行 PCR 筛选验证。
[0045] 1. 4 Δ VdKu70缺陷突变体的确定
[0046] 最初筛选到的突变体在含有潮霉素抗性的PDA培养基继代培养3代以后，转 入液体CM中培养震荡7d (25 °C，200r/min)，收集菌丝，提取总基因组DNA。使用引物 Ku7〇-J_F/Ku7〇-J-R 进行 PCR 验证；然后进行 Southern 分析验证（Tzima A.，Paplomatas E.,Tsitsigiannis D.,et al.The G protein β subunit controls virulence and multiple growth-and development-related traits in Verticillium dahliae. Fungal Genetics and Biology, 2012, 49 (4) : 271-283.)。大约 20 μ g 的单个突变体的 DNA 经 KpnI 酶切后，转移到尼龙膜上，利用地高辛（DIG)标记的900bp的探针[利用DIG-dUTPs(DIG Labeling and Detection kit, Roche)，引物Ku70H-up/Ku70H-dn 或 Hyg H-up/Hyg H_dn，以 野生型大丽轮枝菌的基因组或质粒PUC-Hyg为模板进行PCR扩增获得]进行杂交。
[0047] 1. 5表型特征分析
[0048] Λ VdKu70缺陷菌株的生长和形态学特征分析主要从菌落的直径和产孢量两个方 面分析。
[0049] 菌落的直径的测量：制备2 X IO6孢子/mL的野生型菌株与AVdKu70突变体菌株 的孢子悬浮液，各吸取2ul的孢子悬浮液滴在不同的碳源[蔗糖（30g/L)、木糖（10g/L)、果 胶质（lOg/U、半乳糖（lOg/U、淀粉（17g/L) ] (Tzima A. et al.，2011)的 Czapek 真菌培养 基中心位置，培养到3天、6天、9天、12天、15天时，测量其菌落的大小和观察其形态区别与 变化。
[0050] 产孢量的测定：制备2 X IO6孢子/mL的野生型菌株与AVdKu70突变体菌株的孢 子悬浮液，取2. 0 μ L滴加于PDA培养基中心位置，封口并置于恒温培养箱25°C培养7天后， 统计孢子数（Tzima A. et al.，2012)。
[0051] 1.6UV-照射试验
[0052] 制备IO3孢子/mL的野生型菌株与Δ VdKu70突变体菌株的孢子悬浮液，吸取40ul 均匀的涂在PDA培养基上，分别暴露于紫外灯照射10秒、15秒、20秒、25秒、30秒，封口并 置于恒温培养箱25 °C培养5天后，统计菌落数。
[0053] 1. 7致病性试验和qPCR确定植物体内真菌的生物量
[0054] 将灭菌处理的烟草种子栽培在无菌的环境下，待幼苗长至五到七片真叶时，用已 准备好的IO 6孢子/ml的Λ VdKu70缺陷突变体菌株与野生型菌株孢子悬浮液各自接种两 组烟草幼苗，每组设置三小组（十棵幼苗）重复，十二天以后观察植株的感病状况并统计植 株的病情指数。
[0055] 分析寄主内大丽轮枝菌的生物量的变化，用被接菌并感病的本生烟植株的根、茎、 叶作为qPCR真菌生物量检测的材料，提取DNA，以本生烟的actin (引物见表1)基因作为内 参，真菌的histones 3 (引物见表1)基因作为真菌生物量的检测基因，检测感病本生烟中 真菌的生物量（Tzima A. et al.，2012) 〇
[0056] 表1引物名称及序列
[0057]
【权利要求】
1. 一株大丽轮枝菌（Verticillium dahliae) A VdKu70缺陷突变体菌株，其特征在于， 其微生物保藏编号为：CGMCC No. 10107。
2. 权利要求1所述的大丽轮枝菌AVclKuTO缺陷突变体菌株作为背景菌株在基因打靶 中的用途。
3. 权利要求1所述的大丽轮枝菌AVclKuTO缺陷突变体菌株在研宄大丽轮枝菌侵染机 制中的用途。
4. 权利要求1所述的大丽轮枝菌AVclKuTO缺陷突变体菌株在研宄大丽轮枝菌与寄主 共存机理中的用途。
5. 权利要求1所述的大丽轮枝菌AVclKuTO缺陷突变体菌株在研宄大丽轮枝菌病程关 键基因功能中的用途。
6. -种利用权利要求1所述的大丽轮枝菌AVclKi^O缺陷突变体菌株进行基因打靶的 方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)构建携带靶基因同源重组DNA片段的基因敲除载体，转化农杆菌；（2)利用农杆菌 介导法转化权利要求1所述的大丽轮枝菌△ VdKu70缺陷突变体菌株；（3)筛选转化子，鉴 定，即得。
7. 按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1)采用In-Fusion克隆技术构建 靶基因同源重组DNA片段。
【文档编号】C12N1/15GK104498374SQ201410844647
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】程红梅, 齐希梁, 苏晓峰, 郭惠明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所