一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株，该菌株发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶作用于不同浓度的L-抗坏血酸和β-环糊精，在pH5.0～6.0、25～40℃条件下，可以高效产生2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。利用本发明菌株发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶生产2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸生产方法简单、转化率高、产量高优点，利于工业化放大生产。
【专利说明】一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株，该菌株发酵所得环糊精葡萄糖基转移酶可用于高效生产2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002]抗坏血酸(Ascorbic acid)即维生素C,简称VC,是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。然而，VC分子二位上的羟基极不稳定，受氧、水、光、高温、重金属离子的影响而氧化降解，因此，上世纪以来，开发稳定的VC衍生物成为研究的热点，研究者试图寻找一种VC衍生物，既能保证VC正常生理功能又能有较好的稳定性。如VC的金属盐衍生物及VC的酯类衍生物，但出于安全方面考虑，这些衍生物的应用范围较窄。此外，VC的糖类衍生物因其储存稳定，安全环保而成为VC的最佳替代品。常见的VC糖类衍生物主要有2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)、5-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-5G)、6-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-6G)，虽然AA-5G与AA-6G与VC相比具有具有较好的稳定性，但是与AA-2G相比具有直接的还原性。因此AA-2G的合成及应用有效的解决了当前VC在使用和储存中易氧化的问题。
[0003]AA-2G的结构特征决定了其具有以下特点和功能:1)、AA-2G具有具有良好的非还原活性，在水溶液中特别稳定；2)、AA-2G具有良好的耐光性和耐热性，在100°C条件下放置30min仍保持其活性；3)、AA-2G进入细胞以后经α -葡萄糖苷酶水解生成VC和葡萄糖，具有同VC —样的生物活性，能促进胶原蛋白的合成、治疗坏血病、预防牙龈萎缩、出血、预防动脉硬化、作为抗氧化剂、治疗贫血、抗癌、提高人体免疫力等；4)、AA-2G是卫生署公布认可的6种美白添加剂之一，在许多高端美白化妆品中有着广泛的应用。
[0004]目前生物转化法是合成AA-2G的唯一途径，即利用糖基转移酶的特异性转糖基作用，将葡萄糖基供体上的葡萄糖苷转移到VC的2-位C上。目前为止，已经研究开发了 5种酶类用于AA-2G的生物转化合成，包括α -葡萄糖苷酶、环糊精葡聚糖转移酶、α -淀粉酶、蔗糖磷酸酶和α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。环糊精葡聚糖转移酶因其具有特别强的底物特异性成为目前目前合成AA-2G使用最广泛的酶源，在使用环糊精葡聚糖转移酶生产AA-2G时，作为葡萄糖基供体主要有环糊精、部分淀粉水解物(胶凝淀粉)以及麦芽糊精。日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系首次利用生物转化合成AA-2G，1991年，HajimeAga等人利用来自Bacillus stearothermophilus的环糊精葡萄糖基转移酶,利用20% (w/V) L-抗坏血酸和20% (w/v) α-环糊精在60°C、PH5.5条件下处理20h，接着用葡萄糖淀粉酶处理得到AA-2G对L-抗坏血酸的摩尔转化率达到38% ；2007年，A.A.Markoyan等人利用来自Bacillus stearothermophilus的环糊精葡萄糖基转移酶,利用20% (w/v)L_抗坏血酸和20% (w/v) Y -环糊精在60°C、PH5.5条件下处理48h，接着用葡萄糖淀粉酶处理得到AA-2G对L-抗坏血酸的摩尔转化率达到49%。2011年，Hong-Ki Jun等人利用来自Paenibacillus sp .的环糊精葡萄糖基转移酶,利用3% (w/v)L-抗坏血酸分别与7% (w/v) a -环糊精、0 -环糊精、Y-环糊精在45°C、PH6.0条件下处理24h，接着用葡萄糖淀粉酶处理得到AA-2G对L-抗坏血酸的摩尔转化率分别为5.1%,3.5%,5.9% ;2011年，ZichenZhang等人利用对来自Paenibacillus macerans的环糊精葡萄糖基转移酶的固定化酶,利用5% (w/v) L-抗坏血酸和5% (w/v) ^ -环糊精在45°C、PH5.5条件下处理5d得到AA-2G对L-抗坏血酸的摩尔转化率为22%。
[0005]目前生产AA-2G存在的主要问题是缺乏一种定向以廉价底物获得高转化率的环糊精葡萄糖基转移酶。
【发明内容】
[0006]本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株，分类命名为芽孢杆菌WSH13-117(Bacillusp.WSH13-117)，于2013年9月12日保藏于中国典型微生物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC M2013413。该环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株是从吉林省长白山土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较环糊精葡萄糖基转移酶酶活大小而得到。以该菌为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶，并以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂生产AA-2G，具体步骤为:在反应器中分别添加L-抗坏血酸和(6-环糊精作为底物，添加某种抗氧化剂，用氢氧化钠水溶液调节PH，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在150rpm的水浴摇床中反应一定时间后加入葡萄糖淀粉酶，在150rpm的水浴摇床中进行反应得到AA-2G。
[0007]所述平板分离培养基(g/L)及培养条件:
[0008]可溶性淀粉10，蛋白胨 5，酵母膏 5，K2HPO4 ? 12H201，MgSO4 ? 7H200.2，Na2C035，琼脂15，酚酞0.3，甲基橙0.1。37°C培养箱中恒温培养2-3d，测量D/d(黄色透明圈/菌落直径)值，挑选值较大的进行初筛。
[0009]所述种子培养基(g/L)及培养条件:
[0010]蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0，60°C，摇瓶转速200转/分，培养时间为20-24小时。
[0011 ] 所述发酵培养基(g/L)及培养条件:
[0012]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，60°C，摇瓶转速200转/分，发酵时间44-48小时。
[0013]所述微量元素液(g/L):
[0014]ZnCl22，FeS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0015]所述L-抗坏血酸的终浓度为50g/L~200g/L。
[0016]所述0 -环糊精的终浓度为50g/L~300g/L。
[0017]所述抗氧化剂可以选做亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫脲等，终浓度为5g/L~20g/L。
[0018]所述重组环糊精葡萄糖基转移酶的浓度为300~600U/g ^ -⑶。
[0019]所述重组环糊精葡萄糖基转移酶催化的反应在pH5.0~6.0,25~40°C下进行16 ~24h。
[0020]所述葡萄糖淀粉酶的浓度为50~150U/mL反应液。
[0021]所述葡萄糖淀粉酶催化的反应在50~60°C下进行16~24h。
[0022]本发明筛选了一种·表达环糊精葡萄糖基转移酶的芽孢杆菌，用该酶进行酶反应生2-氧- a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，具有反应方法简便、低能耗、物料成本低等优点，在较高底物浓度下能得到高底物转化率，为工业化放大生产奠定基础。
【具体实施方式】
[0023]实施例1:菌种筛选
[0024]从吉林省长白山附近土壤，按“五点取样法”采取土样10份，从中分离菌株。将少量样品，放入烘箱80°C热处理20min，后称取样品5g加入装有45mL无菌水的小三角瓶中，静置lOmin，上清液取0.1mL梯度稀释(10_5，10_4，10_3)涂布于分离筛选平板上，37°C培养箱中恒温培养2-3d，选取平板上黄色透明圈较大的菌落作为生产CGTase的菌株。挑取单菌落进行3-4次平板划线。之后将筛选得到的几株菌纯化后在60°C进行液体发酵培养44-48h，取培养液离心后收集上清进行酶活测定，选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的环糊精葡萄糖基转移酶产生菌株。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4°C保藏，保藏编号为CCTCC M2013413，保藏机构为中国典型培养物保减中心，保减地址为武汉市武昌洛咖山。
[0025]平板分离培养基(g/L):
[0026]可溶性淀粉10，蛋白胨 5，酵母膏 5，K2HPO4.12H201，MgSO4.7Η200.2，Na2C035，琼脂15，酚酞0.3，甲基橙0.1。
[0027]发酵培养基(g/L):
[0028]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，摇瓶转速200转/分，发酵时间44-48小时。
[0029]微量元素液(g/L):
[0030]ZnCl22，FeS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0031]实施例2:发酵产酶
[0032](I)发酵培养
[0033]将实施例1中筛选得到的产环糊精葡萄糖基转移酶菌株接种于种子培养基中，在60°C下培养20~24h后以5%接种量转接至发酵培养基中，60°C恒温培养44~48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。
[0034]种子培养基(g/L):
[0035]蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH7.0。
[0036]发酵培养基(g/L):
[0037]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0。
[0038](2)酶活测定
[0039]以可溶性淀粉为底物利用甲基橙法测定该酶的酶活。酶活测定体系为2.5mL(含终浓度为2%的可溶性淀粉，50mM KH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH6.0)，在50°C下加入100 μ L适当稀释的酶液反应10min后，加入3Μ盐酸溶液200 μ I终止反应，在16°C下加入0.44mM甲基橙200 μ L显色,在分光光度计505nm处测定吸光值。该条件下每分钟生成I μ mo I α -环糊精所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
[0040]实施例3:粗酶液的浓缩[0041]将实施例2中获得的酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量体积分数26%的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4°C条件下静置8~10小时沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm, lOmin)收集沉淀，再用最小体积的50mM KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH6.0)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清透析后获得浓缩酶液。
[0042]实施例4:酶法制备2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸
[0043]酶法生产工艺:
[0044]在反应器中投入终浓度为50g/L的L-抗坏血酸、200g/L的P -环糊精和10g/L的亚硫酸氢钠，用20%的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.0，加入1000U实例3中获得的浓缩酶液，在35°C，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60U葡萄糖淀粉酶，在60°C,150rpm的水浴摇床中反应24小时。
[0045]HPLC 检测:
[0046]取样并加入同体积的三氯乙酸溶液(10%，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心lOmin，取上清液适度稀释后用0.45 y m超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下:Agilentl200HPLC色谱仪,Agilent自动进样器，AgilentSB-Aq5 V- m(4.6mmX 250mm), LC-9A紫外检测器；流动相为20mM的稀磷酸,流速0.8mL mirT1 ；柱温35°C。
[0047]结果见表1，2-氧-a -D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸对底物L-抗坏血酸的摩尔转化率达58%。
[0048]表1不同实施例下a -CGT的生产情况
[0049]
【权利要求】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株，分类命名为Bacillus sp.，于2013年9月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2013413。
2.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株的筛选方法，其特征是从吉林省长白山土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较环糊精葡萄糖基转移酶酶活大小而得到。
3.应用权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶生产菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征是采用Bacillus sp.为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制得环糊精葡萄糖基转移酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述种子培养中，种子培养基成分为(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10 ;培养条件为:60°C，摇瓶转速200转/分；培养时间为:20-24小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述液体深层发酵中，发酵培养基成分为(g/L):可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸铵2.5，七水硫酸镁0.3，无水氯化钙0.2，ImL(v/v)微量元素液；培养条件为:60°C，摇瓶转速200转/分；发酵时间为:44-48小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素液成分为(g/L):ZnCl22,FeS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
7.权利要求3所述环糊精葡萄糖基转移酶用于合成2-氧-a-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)，包括以下步骤:以环糊精葡萄糖基转移酶生产菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶；以发酵所得粗酶液或浓缩酶液为催化剂生产AA-2G，其特征在于，是在反应器中分别添加L-抗坏血酸和β -环糊精作为底物，添加某种抗氧化剂，用氢氧化钠水溶液调节pH，加入发酵所得粗酶液或浓缩酶液，在150rpm的水浴摇床中进行反应1，反应一定时间后加入葡萄糖淀粉酶，在150rpm的水浴摇床中进行反应2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述L-抗坏血酸的终浓度为50g/L~200g/L ;所述β -环糊精的终浓度为50g/L~300g/L ;所述抗氧化剂可以选做亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫脲等，终浓度为5g/L~20g/L ;所述重组环糊精葡萄糖基转移酶的浓度为300~600U/gP -CD ;所述反应I在pH5.0~6.0,25~40°C下进行16~24h ;所述葡萄糖淀粉酶的浓度为50~150U/mL反应液；所述反应2在50~60°C下进行16~24h。
【文档编号】C12N1/20GK103667102SQ201310463782
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】吴敬, 熊艳军, 王蕾 申请人:江南大学