专利名称：一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法
技术领域：
本发明属涉及一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法属生物技术领域。
背景技术：
甜菊糖(Steviasugar)是从甜叶菊、Stevia rebaudianum Bertoni)的叶子中提取的一种双萜糖苷的混合物，是天然的强力甜味剂，其甜度为蔗糖的150-300倍。经过大量而长期的毒理及药理学研究，已经证明甜菊糖在体内没有潜在性、遗传性等危害，其安全性已经得到了 FAO和WHO等国际组织的认可，2004年7月6日世界联合卫生组织正式通过允许甜菊糖在世界范围内通用的决议，伴随着其安全性被世界认可，其经济效益进一步加大。 近年来，人们对于健康饮食愈发重视，作为甜味剂，甜菊糖因其稳定性强，热量低，热量只相当于蔗糖的1/300，无毒、无副作用等特点，成为人们尤其是肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者等青睐的食品，具有广泛而深远的发展前景。随着甜菊糖的推广，人们发现其具有一种苦涩的后味，虽然甜菊糖具有众多的优点，但在人们多年来形成的口味习惯的影响下，其经济效益在某些地区受到了严重的冲击。 近年来，关于甜菊糖味质改善的研究成为了继甜菊糖安全性研究之后的又一热点问题；可以预见，建立一种高效的专一性的改善甜菊糖味是的方法必然会使整个甜菊糖产业达到一个新的高度。甜菊糖转化技术的现状，化学方法产物复杂，不易分离，可控性差，且效率不高；国内有使用呋喃果糖苷酶作用甜菊糖与蔗糖的混合物达到甜菊糖味质改善的先例，但其产物也是具有多样性和不易分离的缺点，也有利用环糊精糖葡萄糖基转移酶转化甜菊糖苷以改善其味质，采用的酶以α型为主，其产物成分复杂，是具有多种葡糖基一甜菊糖苷的混合物，不利于甜菊糖产业后续的分离提纯步骤，增加的生产成本。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述己有技术的缺点与不足而提供一种用环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法，用β-环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行转化，产生葡萄糖基一甜菊糖苷，从而甜度可以得到显著提升、而且成分单一、分离提纯简单。本发明的目的是通过下列技术方案实现的
一种用环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法，它按下述步骤进行 用水配制成含2-5重量％的甜菊糖苷和2-5重量％的淀粉的反应液，将酶活为60-70U/ ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，转移酶的加入量为300-500 U/甜菊糖苷重量g，在温度为37-50°C进行转化反应48-72小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，所述的β-环糊精葡萄糖基转移酶是用从甜叶菊种植地土壤样品中分离获得β -环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6接种到产酶培养基中， 37°C进行产酶发酵48-72小时，得到的酶活为60-70 U/ml的β -环糊精葡萄糖基转移酶。
所述的高产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6菌落呈圆形凸起，边缘不整齐，浅黄色，半透明，表面湿润，有光泽。细胞直杆状，单个或短链状存在，不运动，可生长温度为 15-45°C，可生长ρΗ为7-12，经生理生化及16S rRNA基因序列分析与同源性比较，该菌株 Y-6为类芽孢杆菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，用脱脂牛奶做成冻干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
本发明的类芽孢杆菌(J^ienibacillus sp. Y_6)的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，类芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 5316，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间2011年10月10日。
从甜叶菊叶片提取出的甜菊糖中，甜菊糖苷(St)是其主要成分，约占60%_70%，甜度为蔗糖的270-300倍，由于甜菊糖苷结构的特殊性，食用后具有一定的不愉快后苦味；其次是甜菊糖A苷(RA)，约占15%-20%，甜度为蔗糖的350-450倍，且其甜味最接近蔗糖，口感较好；其他组分含量均较少。
环糊精糖基转移酶(EC 2. 4.1.19)是α -淀粉酶家族中的一员，系统分类名称为1，4- α -D-葡萄糖基-4- α -D-转移酶，能够催化淀粉发生葡萄糖基转移反应产生环糊精，根据酶主要催化产生的环糊精种类而分为α-、β-和γ-环糊精糖基转移酶三类。本发明选用的β -环糊精葡萄糖基转移酶，它具有多种催化活性，能进行环化、偶合、歧化、水解等反应，是一类具有广泛应用的酶，用β -环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行转化， 能够在甜菊糖苷的13或19位碳上引入糖基，使其转化为葡萄糖基甜菊糖苷，明显改善甜菊糖苷的甜度、口感及味质，转化后的甜菊糖苷产品品质更好，甜度更高，一般转化率可达 70-85%。
nPaenibaciIlus sp. Υ_6接种到产酶培养基中，进行产酶发酵，利用其产生的 β -环糊精葡萄糖基转移酶作为催化剂，以淀粉作为糖基供体，甜菊糖苷作为糖基受体，经过转化作用后甜菊糖苷整体分子将变成疏水性，得到味质改善的葡萄糖基一甜菊糖苷。
β -环糊精葡萄糖基转移酶菌株的选育采用平皿梯度稀释涂布、透明圈、定性及定量的筛选方法，从甜叶菊种植地土壤样品中分离获得高产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6。该菌株可在温度为25-50°C的条件下良好生长，并且可以耐受较广的PH7 - 12范围，环境适应能力很强。
β -环糊精葡萄糖基转移酶的制备将菌株Ami如sp. Y-6接种到产酶培养基中，进行产酶发酵，对培养液进行分离得到的酶液即为反应所需的β -环糊精葡萄糖基转移酶，酶活为60-70U/ml。
由于釆取上述技术方案使本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果(a)本发明选择菌株Y-6为高产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株，β-环糊精葡萄糖基转移酶具有多种催化活性，能进行环化、偶合、歧化、水解等反应，是一类具有广泛应用的酶，此菌株的获得可以丰富现有的环糊精葡萄糖基转移酶菌株资源。
(b)菌株Υ-6可在温度为25_50°C的条件下生长，并且可以耐受较广的ρΗ7- 12，环境适应性强，具有进一步开发成高效工程菌株的潜力。
(C)本发明利用菌株Υ-6进行环糊精葡萄糖基转移酶的生产，通过以淀粉作为糖基供体，甜菊糖苷作为糖基受体的反应体系，经过转化作用后得到味质改善的葡萄糖基一甜菊糖苷，降低了其苦涩味，明显的提高了甜菊糖的味质，为甜菊糖的市场化推广提供了 一定的基础。(d)本发明的方法，利用该菌株产生的环糊精葡萄糖基转移酶对甜菊糖苷进行转化，产物甜度可以得到显著提升，且具有转化率高、成分单一等优点，不仅可以显著提高其味质，还可以解决以往环糊精葡萄糖基转移酶转化产物成分复杂、不易分离提纯等问题。(e)该方法简单、易控制、产品口感好、甜度高。
具体实施例方式实施例1
用从甜叶菊种植地土壤样品中分离获得高产β -环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6接种到产酶培养基中，在温度为37°C进行产酶发酵48-72小时，得到酶活为60-70 U/ml的 β-环糊精葡萄糖基转移酶，备用，取2g甜菊糖苷和2g淀粉溶解于水中得到IOOml的反应液，将8. 57ml酶活为70U/ml的β -环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，在温度为37°C进行转化反应72小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，转化率可达70%。实施例2
取3g甜菊糖苷和3g淀粉溶解于水中得到IOOml的反应液，将35ml酶活为60U/ml的 β -环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，在温度为37°C进行转化反应72小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，转化率可达75%。实施例3
取4g甜菊糖苷和4g淀粉溶解于水中得到IOOml的反应液，将26. 67ml酶活为60U/ml 的β -环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，在温度为50°C进行转化反应48 小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，转化率可达78%。实施例4
取5g甜菊糖苷和5g淀粉溶解于水中得到IOOml的反应液，将35. 71ml酶活为70U/ml 的β -环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，在温度为50°C进行转化反应48 小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，转化率可达85%。
权利要求
1.一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法，其特征在于它按下述步骤进行用纯净水配制成含2-5%重量的甜菊糖苷和2-5%重量的淀粉的反应液，将酶活为 60-70U/ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均勻，转移酶的加入量为 300-500U/甜菊糖苷重量g，在温度为37-50°C进行转化反应48-72小時，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，所述的β-环糊精葡萄糖基转移酶是用从甜叶菊种植地土壤样品中分离获得β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6接种到产酶培养基中，37°C进行产酶发酵48-72小时，得到的酶活为60-70U/ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的高产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株Υ-6菌落呈圆形凸起，边缘不整齐，浅黄色，半透明，表面湿润，有光泽，细胞直杆状，单个或短链状存在，不运动，可生长温度为15_45°C，可生长ρΗ为7-12，经生理生化及16S rRNA 基因序列分析与同源性比较，该菌株Y-6为类芽孢杆菌(Ami如以7ΛΛ5 sp.)，该菌株在中国科学院微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No. 5316，利用脱脂牛奶做成冻干管，-70 °C保存或30%甘油于-80 °C保存。
全文摘要
本发明涉及一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法，其特征在于用水配制成含2-5％重量的甜菊糖苷和2-5％重量的淀粉的反应液，将酶活为60-70U/ml的β-环糊精葡萄糖基转移酶加入反应液中充分混合均匀，转移酶的加入量为300-500U/甜菊糖苷重量g，在温度为37-50℃进行转化反应48-72小时，再进行分离、提纯得到单一的转化产物葡萄糖基-甜菊糖苷产品，该方法具有方法简单、易控制、产品口感好、甜度高的优点及效果。
文档编号C12P19/56GK102492757SQ20111037973
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者于学健, 袁红莉 申请人:中国农业大学