一种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌及其应用。本发明所述的菌株的保藏号为：CCTCC?NO:M2013407，该菌株16s?rDNA的Genbank登录号为KF512664。应用时，将菌株制备成能对玉米赤霉烯酮毒素降解的液体菌剂或固体菌剂，用于降解饲料产品或谷物中的玉米赤霉烯酮毒素。本发明的优点是：利用该菌生物降解玉米赤霉烯酮毒素，安全性高，可专一、高效地降解饲料产品和农产品污染的玉米赤霉烯酮毒素，达到提高饲料产品和农产品的质量。
【专利说明】—种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分解玉米赤霉烯酮毒素的菌种，尤其是一种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌，以及该菌在饲料产品中的应用。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),又称F-2毒素,是一种酹的二羟基苯酸的内酯结构，有较强的雌激素活性。该毒素热稳定，并不因长期储存、烘烤或丙酸或霉菌生长抑制剂的加入而受到破坏。
[0003]玉米赤霉烯酮在人和动物体内积累可诱发一系列雌激素效应症状，包括影响雌性哺乳动物乳房发育、外阴阴道炎、发情周期紊乱、假孕不孕、流产、死胎畸胎等，此外有研究证实，玉米赤霉烯酮还有遗传毒性，细胞毒性，免疫毒性，致肿瘤毒性。
[0004]玉米赤霉烯酮存在于世界范围的多种谷物作物中，如:玉米、大麦、燕麦、小麦、稻、和高粱。在收获前玉米赤霉烯酮的产生通常没有显著的量的发生，但在合适的环境条件下，易在储减中的玉米和小谷粒上广生。
[0005]在乙醇生产中使用谷物颗粒并消耗淀粉时，玉米赤霉烯酮集中在发酵副产品(如:蒸馏干酒糟)中。发酵副产品中的玉米赤霉烯酮含量相对于谷物颗粒可能还会增加。
[0006]在CN102010838A (采用蜡样芽孢杆菌E33L)、CN102559555A (采用不动杆菌Acinetobacter sp.SM04)、CN102796694A (导入了脱氧雪腐镰刀烯醇和玉米赤霉烯酮两种降解酶编码基因的工程菌)中分别公开了采用不同的微生物来分解玉米赤霉烯酮，但是它们所使用的微生物均为目前未被列入可用于饲料添加使用的安全微生物。
·[0007]在CN102406098A (采用黑曲霉发酵液干粉)、CN102181376A (采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB0IG)中也分别公开了使用微生物分解玉米赤霉烯酮的应用。
[0008]因此，仍有必要寻找可用于饲料产品添加的分解真菌毒素玉米赤霉烯酮的新的微生物，并将其应用于受玉米赤霉烯酮毒素污染的动物饲料产品中分解毒素。
【发明内容】
[0009]本发明的第一个目的在于提供一种分解真菌毒素玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),从而解决饲料中残留玉米赤霉烯酮毒素的问题。
[0010]本发明所述的一种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),其菌株的保藏号为CCTCC N0:M2013407，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学；保藏日期为2013年9月10日。所述菌株能在营养肉汁琼脂培养基上生长，菌落圆形，扁平，边缘完整，不透明；菌体为短棒状，大小为2~4X0.5 μ m，革兰氏阳性；芽孢大小为1.0~1.2X 1.5~2.0 μ m，椭圆形，中生或次端生，孢囊不明显膨大；所述菌株能利用的碳源有:D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、柠檬酸盐、纤维素、β-葡聚糖和D-甘露醇；不能利用的碳源有:甘油、淀粉、果糖、麦芽糖；所述菌株的16S rDNA全基因序列的Genbank登录号为KF512664。[0011]本发明的另一个目的在于提供所述的短小芽孢杆菌的用途，具体是用于制备分解玉米赤霉烯酮的菌剂的应用。
[0012]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的菌剂为液体菌剂，通过以下方法制备:
[0013]a)将所述短小芽孢杆菌的菌株于种子培养基中培养，获得菌种；
[0014]b)将上述种子液接种入含有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
[0015]c)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产发酵罐发酵培养，出罐形成能分解玉米赤霉烯酮的液体菌剂。
[0016]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的种子培养基为由下列组分组成:胰蛋白胨10g/L,酵母浸膏5g/L, NaCl5g/L, ρΗ7.0~7.2。
[0017]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的发酵培养基为由以下组分组成:葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏lg/L，牛肉浸膏0.1g/L, KH2P042g/L, K2HP042g/L, MgSO4.7H200.5g/L, NaC15g/L, pH7.0 ~7.2。
[0018]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的种子培养基和发酵培养基需要121°C高温湿热灭菌后冷却至30~35°C使用。
[0019]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的菌种按种子罐种种子培养基的3 - 10%接种量种入种子罐，优选5%接种量，更优选10%的接种量。
[0020]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的种子液按生产罐种发酵培养基的3 - 10%接种量接种入生产罐，优选5%接种量，更优选10%的接种量。
[0021]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过程种无菌空气的同期量为1:0.5~1.5，搅拌速度为100~250转/分，培养时间为24~60小时，培养温度为25~35°C，优选为28~32°C。
[0022]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，发酵结束后获得液体菌剂中，菌体数量≥1O9个/ml，优选≥1O12个/ml，或者更优选≥1O15个/ml。
[0023]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，将所述的短小芽孢杆菌液体菌剂稀释之后喷施到饲料产品中以降解饲料产品中的玉米赤霉烯酮毒素；稀释后的液体菌剂中菌体数量至少达到IO6个/ml。
[0024]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的短小芽孢杆菌液与糠麸或黏土吸附剂按Iml:1 — 20g的比例吸附，优选Iml:5 — IOg的比例吸附，形成固体菌剂，其中菌体数量> IO8个/g，优选> 101°个/g，或者更优选> IO15个/g。
[0025]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述的短小芽孢杆菌固体菌剂的剂量是0.5g菌剂/kg饲料,优选Ig菌剂/kg饲料,或更优选2g菌剂/kg饲料。
[0026]根据本发明所述的短小芽孢杆菌的应用的进一步特征，所述饲料是选自以下谷物的饲料产品:玉米、小麦、大麦、稻谷、高粱、或蒸馏干酒糟。
[0027]本发明的有益效果在于:短小芽孢杆菌是允许直接饲用的益生微生物，具有饲用安全性，且短小芽孢杆菌具有抗逆性强、耐高温、对营养要求简单、易贮存等独特的特性，本发明用于污染饲料产品中的玉米赤霉烯酮毒素的降解，可有效提高饲料利用率。【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明所述的短小芽孢杆菌的液体菌剂对玉米赤霉烯酮毒素的降解效果。【具体实施方式】
[0029]以下对本发明的说明书所涉及的名词做出说明。
[0030]玉米赤霉烯酮
[0031] 术语“玉米赤霉烯酮”包括自某些镰孢属菌种(Fusarium sp.)产生的真菌毒素玉米赤霉烯酮。IUPAC名称为(4S，12E)- 15，17 一二羟基一 4 一甲基一 3 —氧杂二环[12.4.0]十八碳一12,15,17,19 —四烯一2,8 —二酮((4S, 12E)-15, 17-Dihydroxy-4-methyl-3-oxabicyclo[12.4.0]octadeca-12, 15, 17, 19-tetraene~2, 8_d ione)。术语“玉米赤霉烯酮”还包括任何玉米赤霉烯酮的衍生物。
[0032]动物饲料产品
[0033]术语“动物”包括所有动物，包括人。动物的实例是牛，包括但不限于乳牛/母牛和牛犊；单胃动物，例如猪，包括但不限于小猪、饲育猪和母猪；家禽如火鸡和鸡，包括但不限于雏鸡、蛋鸡；和鱼，包括但不限于鲑鱼。
[0034]术语“饲料产品”可以是与不想要的水平的玉米赤霉烯酮分离的产品，其适合于由动物食用。所述饲料产品也可以是疑似包含不想要的水平的玉米赤霉烯酮的产品，和/或玉米赤霉烯酮水平未知的产品，包括不包含科检测水平的玉米赤霉烯酮的产品。
[0035]所述饲料产品优选是基于谷粒的产品优选包含谷物，例如，玉米、小麦、大麦、稻、高粱中的一种或多种。在一个实施方案中，所述饲料产物可以例如仅源自一种或多种谷物，而在另一个实施方案中部分源自豆类(例如源自大豆)且部分源自谷物。所述基于谷粒的产品可以包含完整的或研磨的谷粒，例如，湿磨或干磨的谷粒，包括包含湿磨或干磨谷粒的级分的基于谷粒的产品，所述级分例如，谷蛋白、蛋白质、淀粉和/或油级分。还优选包含来自酿造和/或发酵过程的副产品(例如，酒糟)的产品。酒糟是来自酒精饮料和乙醇燃料生产的副产品。啤酒酒糟是酿酒厂中啤酒酿造的残余物，这种酿酒厂使用发芽大麦作为主要原料。蒸馏酒糟是在从发酵的谷粒如:玉米、小麦、大麦、稻和黑麦通过蒸馏去除醇之后在蒸馏室中剩余的产品。蒸馏酒糟也称作酒糟。将湿酒糟干燥生产酒糟，其主要用作动物饲料。
[0036]短小芽抱杆菌(Bacilluspumilus)
[0037]在本发明的上下文中，术语“短小芽孢杆菌”属于短小芽孢杆菌属的对玉米赤霉烯酮有分解作用的菌株。
[0038]实施例1:短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) BFB86330的获得
[0039]材料:实验材料为:广东肇庆采集的发酵食品材料酒饼
[0040]称取IOg实验材料经研碎、加水振荡制成样品悬液，梯度稀释得到样品液。取三个浓度梯度样品液各ImL分别加入营养肉汁琼脂培养基中(含泛酰内酯50mg/L)，凝固后置于30°C恒温箱中倒置培养24h。第一次培养结束后，挑取生长良好的典型单菌落，在相同条件下，划线分离获得纯培养，进行分类编号，试管斜面保种-1o°c保存。另外，加大培养基中泛酰内酯浓度到10g/L进行第二轮的液体培养富集。对照组:将菌株接种至不含泛酰内酯的培养基中培养。培养条件:30°C，180r/min，24h ;能够生长的菌株继续进行下面的压力培养。
[0041]按1:100接种量向营养肉汁培养基(含ZEN浓度为10 μ g/mL)接种，30°C，180r/min,培养24h ;培养结束后，取菌悬液ImL制备TLC检测样品，对培养液中ZEN残留进行TLC检测。选择检测液10 μ L点样量荧光点完全消失所对应的菌株，在ZEN浓度为20 μ g/mL的培养基中培养，取生长良好的菌悬液ImL制备TLC检测样品，观察样品的荧光亮度确定各个菌株对玉米赤霉烯酮分解能力的相对大小，确认具有分解ZEN的菌株，确定名称为BFB86330。
[0042]TLC检测参照AOAC Official Method976.22:菌悬液经氯仿萃取三次，无水Na2SO4脱水，获得含残留ZEN的TLC检测样品，在经活化的硅胶板上点样，经展开剂(VCHC13: VCH30H=95:5)展开，干燥，在365nm紫外光下，观察黄绿色荧光变化。检测样品的点样分别为10 μ L，15 μ L，20 μ L3个梯度。
[0043]菌株的鉴定
[0044]克隆短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus) BFB86330的16s rDNA序列并对该16srDNA序列进行测序，把测序结果在Genbank进行BLAST比对分析序列同源性，确定了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) BFB86330的系统分类学地位。通过短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) BFB86330的形态生物学鉴定结果、生理生化特征结果和系统分类学地位鉴定结果，最终把短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) BFB86330鉴定为短小芽孢杆菌属(Bacilluspumilus)细菌。菌种BFB86330的16s rDNA序已经登录到Genbank,登录号为KF512664。
[0045]将该短小芽孢杆菌的菌株BFB86330送交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为 CCTCC N0:M2013407o [0046]为简化说明，在下文中，将本发明所述的短小芽孢杆菌的菌株用BFB86330表示。
[0047]实施例2:液体菌剂的制备
[0048]种子培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl5g/L, pH7.0~7.2。
[0049]发酵培养基:葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏lg/L，牛肉浸膏 0.lg/L, KH2P042g/L, K2HP042g/L, MgSO4.7Η200.5g/L, NaC15g/L, ρΗ7.0 ~7.2。
[0050]将BFB86330种接种于含200ml种子培养基的1000ml摇瓶中，30°C振荡培养至对数生长期，获得菌种。
[0051]将上述培养好的菌种按10%接种量接种入200L种子罐中(含种子培养基160L，121°C高压湿热灭菌，冷却至30°C)进行培养，获得种子液。培养条件:搅拌速度180~230转/分，无菌空气通入量1:0.8，培养6-8小时。
[0052]将上述种子液按10%接种量接种入2000L生产罐(含发酵培养基1600L，121°C高压湿热灭菌，冷却至35°C以下)进行发酵生产，获得BFB86330菌液。发酵条件:搅拌速度150~200转/分，无菌空气通入量1:0.8-1.0,培养16~45小时。
[0053]实施例3:固体菌剂的制备例一
[0054]将实施例2生产出来的BFB86330菌液和糠麸(从商业途径购买)按照1:5 (体积:重量)的比例混合制成BFB86330固体菌剂。
[0055]实施例4:固体菌剂的制备例二
[0056]将实施例2生产出来的BFB86330菌液和粘土 (从商业途径购买)按照1:5 (体积:重量)的比例混合制成BFB86330固体菌剂。[0057]实施例5:液体菌剂对玉米赤霉烯酮毒素的降解实验
[0058]按1:100接种量向营养肉汁培养基(含ZEN浓度为20 μ g/mL)接种，30°C，180r/min,培养24h ;培养结束后，取菌悬液5mL进行层析分析。层析分析:参照AOAC OfficialMethod976.22:菌悬液经氯仿萃取三次，无水Na2SO4脱水，获得含残留ZEN的检测样品，取ImL检测样品挥干，加入ImL甲醇(色谱纯)振荡，0.45 μ m滤膜过滤，得到待测样品，用HPLC定量检测残留ZEN。色谱条件:C0SM0SIL5C18-MS II型色谱柱，流动相:甲醇-水=65:35(v/V)，流速:lmL/min,柱温:30°C, RF-10AXL 突光检测器:入 ex=274nm, λ em=440nm。结果如图1所示，本发明所述的菌株所制备的液体菌剂对于玉米赤霉烯酮毒素具有很好的降解效果。
[0059]实施例6:固体菌剂对饲料中玉米赤霉烯酮毒素的降解效果
[0060]BFB86330固体菌剂按Ig固体菌剂/kg干物质的剂量与想处理的已经被玉米赤霉烯酮污染的饲料混匀，再按1:1重量比喷洒入水，在30°c处理4小时后，称取5g进行层析分析。对照组用等量的菌剂辅料替代。层析分析:参照AOACOfficial Method976.22:处理物经氯仿萃取三次，无水Na2S04脱水，获得含残留ZEN的检测样品，取ImL检测样品挥干，加入ImL甲醇(色谱纯)振荡，0.45μπι滤膜过滤，得到待测样品，用HPLC定量检测残留ZEN。色谱条件:C0SM0SIL5C18-MS II型色谱柱，流动相:甲醇-水=65:35 (v/v)，流速:lmL/min，柱温:30°C, RF-10AXL突光检测器:λ ex=274nm, λ em=440nm。相对于对照计算残余的玉米赤霉烯酮。结果表1,BFB86330固体菌剂能很好降解饲料中的玉米赤霉烯酮，降解效率可达到 80%ο
[0061]表1
【权利要求】
1.一种分解玉米赤霉烯酮的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),其特征在于:所述短小芽孢杆菌的菌株的保藏号为CCTCC N0:M2013407 ； 所述菌株能在营养肉汁琼脂培养基上生长，菌落圆形，扁平，边缘完整，不透明；菌体为短棒状，大小为0.5~0.7 μ mX 2~4 μ m,革兰氏阳性；芽孢大小为1.0~1.2 μ mX 1.5~2.0 μ m，椭圆形，中生或次端生，孢囊不明显膨大； 所述菌株能利用的碳源有:D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、柠檬酸盐、纤维素、β -葡聚糖和D-甘露醇；不能利用的碳源有:甘油、淀粉、果糖、麦芽糖； 所述菌株的16S rDNA全基因序列的Genbank登录号为KF512664。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌用于制备分解玉米赤霉烯酮的菌剂的应用。
3.根据权利要求2所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述的菌剂为液体菌剂，通过以下方法制备: a)将所述短小芽孢杆菌的菌株于种子培养基中培养，获得菌种； b)将上述种子液接种入含有种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液； c)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产发酵罐发酵培养,出罐形成能分解玉米赤霉烯酮的液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于: 所述的种子培养基为由下列组分组成:胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaC15g/L, ρΗ7.0 ~7.2 ; 所述的发酵培养基为由以下组分组成:葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏 lg/L,牛肉浸膏 0.lg/L，KH2P042g/L，K2HP042g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，NaCl5g/L, ρΗ7.0 ~7.2。
5.根据权利要求3或4所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述的种子培养基和发酵培养基需要121°C高温湿热灭菌后冷却至30~35°C使用；所述的菌种按种子罐种种子培养基的3 - 10%接种量种入种子罐，优选5%接种量，更优选10%的接种量；所述的种子液按生产罐种发酵培养基的3 — 10%接种量接种入生产罐，优选5%接种量，更优选10%的接种量。
6.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过程种无菌空气的同期量为1:0.5~1.5，搅拌速度为100~250转/分，培养时间为24~60小时，培养温度为25~35°C，优选为28~32°C，发酵结束后获得液体菌剂，其中菌体数量≤109个/ml，优选≥IO12个/ml，或者更优选≥IO15个/ml。
7.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:将所述的短小芽孢杆菌液体菌剂稀释之后喷施到饲料产品中以降解饲料产品中的玉米赤霉烯酮毒素；稀释后的液体菌剂中菌体数量至少达到IO6个/ml。
8.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述的短小芽孢杆菌液与糠麸或黏土吸附剂按Iml:1 — 20g的比例吸附，优选Iml:5 — IOg的比例吸附，形成固体菌剂，其中菌体数 量> IO8个/g，优选> IOltl个/g，或者更优选> IO15个/g。
9.根据权利要求8所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述的短小芽孢杆菌固体菌剂的剂量是0.5g菌剂/kg饲料,优选Ig菌剂/kg饲料,或更优选2g菌剂/kg饲料。
10.权利要求7或9所述的短小芽孢杆菌的应用，其特征在于:所述饲料是选自以下谷物的饲料产品:玉米、小 麦、大麦、稻谷、高粱、或蒸馏干酒糟。
【文档编号】C12N1/20GK103627652SQ201310463660
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】刘大岭, 姚冬生, 冼钰茵, 孙志轩, 谢春芳, 刘桂祯, 梁玉强, 梁钟, 邵伟琪 申请人:暨南大学, 开平牵牛生物科技有限公司