人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒检测技术领域，特别是人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELI SA试剂盒。
【背景技术】
[0002]β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β1，3半乳糖基转移酶7基因(ΑΥ277592 EC2.4.1-)是由苏州大学吴士良教授课题组通过电子克隆方法在国际上首先克隆得到并初次命名为βI，3半乳糖基转移酶的一个β3糖基转移酶大家族的新基因，对这个基因我们实验室已经进行了克隆和表达的研究，之后日本学者对其进行酶活测定后重命名为β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶(KGnT8)。近期本室对其催化功能进行进一步的验证研究即分别进行β1，3半乳糖基转移酶和β3-Ν-乙酰氨基葡萄糖转移酶反应体系的酶促反应，利用高效液相色谱(HPLC)进行结果检测，表明KGalT7同时具有较弱的β1，3半乳糖基转移酶和较高的β3-Ν-乙酰氨基葡萄糖转移酶的活性，故初步重命名为β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶(i33GnT8)/m，3半乳糖基转移酶W3GalT7)，缩写为03GnT8或03GalT7。
[0003]i33GnT8在肿瘤标志抗原多聚乳糖胺合成中扮演重要角色。近年来国外及我们的研究表明，i33GnT8在多种人肿瘤组织中存在异常高表达。它催化合成的多聚乳糖胺结构是一种特有的含有N-乙酰乳糖胺(LacNAc)重复序列的聚糖，它添加在O-聚糖，N-聚糖以及糖脂上.多聚乳糖胺结构常被修饰携带一些重要的碳水化合物结构，比如Lewis相关抗原，HNK-1抗原等，发挥着重要的生理病理功能。在肿瘤转移层面，多聚乳糖胺及其相关结构在细胞间相互作用、细胞与胞外基质间的作用、免疫反应以及癌细胞迀移能力中占有重要角色。已有研究表明，三天线、四天线N-聚糖β?，6分支上的多聚乳糖胺结构参与众多的肿瘤恶性表型，影响着细胞增殖和迀移能力。
[0004]我们已于2010年成功研制了兔抗人i33GnT8多克隆抗体，研究表明该抗体在免疫分析中有着较佳的应用，并且具有较高特异性，而这些工作也就解决了该试剂盒研制中的最关键问题之一。应用双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附实验)试剂盒的方法对i33GnT8的检测，具有操作简单、快速、灵敏、准确的特点。而且应用ELISA法对肿瘤患者的糖基转移酶筛查已经有相关报道，如像神经酰胺等ELISA试剂盒已经用于肿瘤患者或病毒感染患者血清的筛查，均表现出了良好的应用价值与前景。本发明将首次运用双抗体夹心ELISA检测i33GnT8的方法对结肠癌等肿瘤患者进行筛查;通过该试剂盒对肿瘤临床样本的筛查，用该试剂盒定量检测患者血清中P3GnT8的含量。通过对不同类型癌症患者血清中03GnT8的含量与正常人血清含量比较，借助这些差异给肿瘤早期发现能提供一个重要的参考依据，而这些工作将会具有极大地应用前景和开发价值。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题是提供一种特异性强、精确度高、操作简便、快速的抗人03GnT8双抗体夹心ELISA试剂盒。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELI SA试剂盒，包括:洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、包被抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体、标准对照蛋白。
[0007]优选的是，所述包被抗体的酶标板是以鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8单克隆抗体为包被抗体，用包被液将包被抗体稀释，每孔加入稀释后的包被抗体，并在过夜包被后用洗涤液洗涤;再向酶标板中加入封闭液，等待反应，最后洗涤液洗涤。
[0008]优选的是，所述检测抗体是兔抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8多克隆抗体。
[0009]优选的是，所述酶标抗体是辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。
[0010]优选的是，所述标准对照蛋白:包括阳性对照i33GnT8蛋白和阴性对照大肠杆菌菌体蛋白。
[0011 ]优选的是，所述包被抗体被包被液稀释后的浓度是5yg/mL，稀释后的包被抗体每孔加入量为10yL，过夜包被的温度为4°C;过夜包被后洗涤液洗涤次数为3?4次;酶标板中加入封闭液的量为每孔10yL，酶标板中加入封闭液的反应温度是37°C，反应时间为1~2小时，反应结束后洗涤液洗涤次数为3~4次。
[0012]优选的是，所述的包被抗体的制备方法为:
第一，将β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白与弗氏完全佐剂混合，用BALB/c小鼠进行皮下免疫；
第二，分别于BALB/c小鼠初次后，更换为弗氏不完全佐剂对BALB/c小鼠进行第二次和第三次免疫；
第三，在BALB/c小鼠第三次免疫对BALB/c小鼠进行腹腔注射加强免疫；
第四，按照常规杂交瘤制备方法制备脾脏B淋巴细胞与SP2/0细胞的融合杂交瘤细胞株，进行单克隆细胞分选培养，经包被β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白的ELISA筛选鉴定获得阳性杂交瘤细胞株；
第五，借助BALB/c小鼠腹水瘤制备鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8单克隆抗体，腹水经分离纯化后获得用于双抗体夹心ELISA试剂盒的包被抗体。
[0013]优选的是，所述第一步中β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白与弗氏完全佐剂的混合比例为1:1;每只BALB/c小鼠免疫总量0.2mL进行皮下免疫;所述第二步中对BALB/c小鼠进行第二次和第三次免疫的具体时间是在BALB/c小鼠初次免疫3周后和5周后;第三步中对BALB/c小鼠进行腹腔注射加强免疫的具体时间是在BALB/c小鼠第三次免疫2周后且细胞融合前I天。
[0014]上述方案中，所述的包被液配制方法为:1.59g Na2C03，2.93g NaHC03，去离子水溶解并定容至1L。
[0015]本发明的有益效果是:提供一种人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，利用抗人f33GnT8单克隆抗体和抗人f33GnT8多克隆抗体，制备抗人f33GnT8双抗体夹心ELISA试剂盒;其采用抗人f33GnT8单克隆抗体和抗人f33GnT8多克隆抗体作为该试剂盒中的包被抗体和检测抗体，有力的排除非特异性干扰，并且能够实现对抗原蛋白的不同表位检测，使结果更具准确性。而且本发明的检测操作简单、快速、检测成本低、适用于大规模样品的检测，易于推广普及。其采用双抗体夹心酶联免疫吸附ELISA法，用该试剂盒定量检测患者血清中i33GnT8蛋白水平的含量，尤其是结肠癌患者。通过结肠癌患者血清i?GnT8蛋白水平的高低，并与正常人血清水平对比，借助这些表达差异为结肠癌的早期诊断提供一个重要的参考依据。
[0016]
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0018]一、鼠抗人f33GnT8单克隆抗体的制备 I.抗原致敏B淋巴细胞的免疫小鼠获得
β36ηΤ8原核表达并纯化的蛋白样本用0.0IM I3BS (ρΗ7.2) 1 X稀释后加等体积的弗氏完全佐剂充分混匀后按30ug/只蛋白剂量注射于5只5周龄雌性的SPF级Balb/c小鼠腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白剂量加弗氏不完全佐剂腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30ug/只蛋白剂量(无佐剂)进行四免，四免后5?7天，眼眶静脉采血取血清作待测抗体；以所述03GnT8纯化蛋白(lmg/ml)作固定标准抗原，做间接ELISA，效价超过1: 1000表明已经获得了能产生较高效价针对原核表达产物特异性抗体的免疫小鼠，同时说明该小鼠脾脏内已有抗原致敏B淋巴细胞克隆。
[0019]2.融合细胞克隆的获取和分泌抗体克隆株的筛选 a.融合细胞生长克隆培养
无菌取上述一只合格小鼠脾，将其置于无菌培养皿中，10%FBS+RPM1-1640洗涤2-3次后剪成小块，用无菌玻璃片研磨，挤出脾细胞，30-40ml 10%FBS+RPMI 1640吹散重悬细胞，过200目尼龙膜进行细胞筛后(单细胞易于细胞融合)再用RPM1-1640培养基洗涤2-3次并计数；