用于肺癌诊断的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物样品检测领域，涉及肺癌患者标志物及其应用。
[0002]背景介绍
[0003] 肺癌是当今世界上最常见也是死亡率最尚的癌症之一，它是男性癌症患者中最主 要的癌症类型，占新增癌症病例总数的17%和癌症死亡病例的23%，而且在北美、欧洲部分 地区和中国也是女性最常见的癌症死亡类型。据估计，2012年有226160例被诊断为肺癌的 新增病例，其中160340例将死于肺癌。有超过一半的肺癌患者(56%)在确诊时或者已处于 进展期，或者已发生远处转移，即使辅以化疗，生存期仍只有一年或更短。因此肺癌的早期 发现和鉴别诊断非常重要。在肺癌的所有病理类型中，非小细胞肺癌(NSCLC)占80-85%，肺 癌的早期阶段通过手术切除可以最大可能地实现长期生存。目前，临床所使用肺癌筛查诊 断方法主要是胸部X射线检查、CT扫描等影像学技术。虽然这些影像资料对诊断起着重要作 用，但也存在很多局限性，例如假阳性率高，无法检出隐性病灶、亚临床病灶和微小转移病 灶。除此之外，对肺癌的诊断方法还包括支气管镜检查、穿刺活检等有创操作，这类方法耗 时长，增加患者痛苦。因此，寻找无创、无辐射、费用低廉、诊断快速且敏感性、特异性均高的 筛查、诊断方法，是目前肺癌早期诊断的迫切需求。
[0004]肿瘤标志物是指肿瘤细胞或者组织由于癌基因或其他肿瘤相关基因及其产物异 常表达所产生的生物活性物质或其本身由癌组织脱落，而在正常组织或良性疾病时有一定 程度表达或产量甚微。它反映了癌的发生发展过程，可在肿瘤患者组织、体液及排泄物中检 出，广泛应用于肿瘤的诊断，监测复发、转移，预后，预测疗效等。临床上现有的广泛受到认 可的几种主要标志物为:应用于卵巢癌的肿瘤抗原125(CA125)，应用于胰腺癌的类抗原 19-9(CA19-9)，应用于结直肠癌的癌胚抗原(CEA)和应用于前列腺癌的前列腺特异性抗原 (PSA)。而其他癌症例如乳腺癌和肺癌，目前仍然缺少用于筛查的可信的肿瘤标志物。
[0005]目前已经应用于肺癌临床辅助诊断的标志物只有蛋白标志物，为下列几种：
[0006] (l)CEA:Gold和Freeman在1965年首先在大肠癌中发现CEA，它是一种糖蛋白，分子 量为180KD，半衰期为3-4天，是胚胎发展过程产生的抗原，出生后显著下降；其特异性不强， 但可用于肿瘤发展的监测、疗效判断和预后估计，对于早期诊断并不敏感;肺癌病人虽有升 高，但存在较高的假阴性和假阳性，不适于在肺癌筛查诊断中单独使用；
[0007] (2)0六125:8&#在1981首先发现0六125这种大分子糖蛋白，其半衰期约4.8天，主要 应用于卵巢癌，同时在肺癌中也有上升；
[0008] (3)CYFRA21-1(CYFRA211):CYFRA211是细胞角蛋白19的水溶性片段，半衰期约4 天；
[0009] 虽然目前以上蛋白标记物已经用于肺癌的辅助诊断，但其诊断效率低下，达不到 临床需求。
[0010] 此外，现有技术多采用电化学发光免疫测定法(ECLI)或放射免疫测定法(RIA)来 检测标志物，虽然ECLI操作简单、快速且具有较高的灵敏度和特异度，但检测成本相对较 高;RIA则有放射性，对人体有害。相比之下，酶联免疫吸附法(ELISA)的设备和操作更为简 单、实验成本较低，但其敏感性和特异性较差(何国坚等人，电化学发光免疫分析法检测维 生素 D试剂盒性能验证。中国医药指南，第12卷第23期，2014年8月）。因此，临床亟需找到一 种具有高敏感性和高特异性并且成本低廉的肺癌早期诊断方法。
[0011]催乳素(Prolactin，简称PRL，又叫促乳素或催乳激素)是一种由垂体前叶腺嗜酸 细胞分泌的蛋白质激素。主要作用为促进乳腺发育生长，刺激并维持泌乳，还有刺激卵泡LH 受体生成等作用。本发明人研究发现，早期肺癌患者中的血浆催乳素水平明显高于正常人 群，能够作为肺癌的诊断标志物。
【发明内容】
[0012]本发明旨在提供一种具有尚敏感性和尚特异性且成本低廉的临床检测方法，以在 人类受试者特别是中国人群中早期并可靠地诊断肺癌。
[0013] 总体而言，本发明涉及用于诊断肺癌的方法和试剂盒，其包括检测受试者的催乳 素水平特别是血浆催乳素水平，以鉴定所述受试者是否患有肺癌或处于患有肺癌的风险 中。本发明还涉及检测受试者血浆中癌胚抗原和细胞角蛋白19的水平，以与所述受试者血 浆中催乳素的水平联合用于诊断肺癌。
[0014] 在一个方面，本发明涉及用于诊断肺癌的方法，其包括检测受试者的催乳素水平， 以鉴定所述受试者是否患有肺癌或处于患有肺癌的风险中。
[0015] 在另一方面，本发明涉及用于诊断肺癌的方法，其包括检测受试者的催乳素和其 它标志物的水平。所述其它标志物可选自不限于癌胚抗原（CEA)、鳞状细胞癌相关抗原 (SCC-Ag)、细胞角蛋白19(CYFRA21-1)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗 原199(CA199)、神经特异性烯醇化酶(NSE)、组织多肽抗原(TPA)、胃泌素释放肽前体(pro-GRP)、血清溶血磷脂酸(LPA)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)、STAT3或其组合中的一种或多 种。优选地，所述其它标志物包括癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19(CYFRA21-1)。
[0016] 在一些实施方案中，所述诊断是早期诊断。
[0017]在本文中，术语"受试者"、"患者"、"病人"可互换使用，其指适用于本文所述方法 的任何受试者。受试者可以是哺乳动物。优选地，受试者是人，例如但不限于欧洲人群、北美 人群和/或中国人群。优选地，受试者是中国人群。如本文所用，术语"水平"是指根据本发明 的生物标志物的蛋白质和/或DNA和/或RNA的拷贝数。生物标志物的水平可以是例如但不限 于，血浆水平、血清水平、组织液水平和/或胸水水平，优选为血浆水平。检测血浆水平的益 处包括例如，容易收集、对人体伤害少、成本较低、不需等待血液凝固、节省时间等。健康水 平或正常水平是指健康受试者中生物标志物的水平。健康受试者是指经体检，依据病理诊 断资料没有发现肺癌的受试者。
[0018] 在一些实施方案中，所诊断的肺癌包括小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌。优选地， 所诊断的肺癌是非小细胞肺癌。非小细胞肺癌包括但不限于鳞癌、腺癌、大细胞癌。
[0019] 本发明已令人惊讶地发现，当受试者的催乳素水平相较于健康受试者的正常催乳 素水平升高约2倍或更高，例如高于约20.00ng/ml时，能够以极高的准确率诊断肺癌的存 在。当与其它标志物例如癌胚抗原和细胞角蛋白19联用时，诊断准确率进一步增高。根据这 样的诊断结果，本领域技术人员能够通过与医学影像学、患者临床特征表现等其它方法联 合检查，从而进一步确诊肺癌。
[0020] 在一些实施方案中，检测受试者的催乳素或其它标志物的水平的方法可以是酶联 免疫吸附法(ELISA)。在其它实施方案中，检测受试者的催乳素或其它标志物的水平的方法 还可以是放射免疫法(RIA)或化学发光免疫测定法（CLIA)，例如电化学发光免疫测定法 (ECLI)。优选地，检测受试者的催乳素或其它标志物的水平的方法是酶联免疫吸附法 (ELISA)。应理解，本领域技术人员可以使用本领域已知的任何生物标志物检测技术来检测 受试者的催乳素或其它标志物的水平。
[0021] 在一些实施方案中，本发明涉及使用抗体来检测受试者的催乳素或其它标志物的 水平。
[0022] 如本文所用的术语"抗体"是指特异性结合至特定抗原或与特定抗原免疫应答的 免疫球蛋白分子，并且包括抗体的多克隆、单克隆、遗传工程化和以其它方式修饰的形式， 包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异缀合抗体（例如，二_、三-和四-特异性抗体、 diabody、tr iabody和tetrabody)以及抗体的抗原结合片段包括例如Fab '、F(ab'）2、FAB、 FV、rIgG和scFv片段。抗体可以包括嵌合的、灵长类化的、人源化的或人抗体。可与本发明相 关使用的抗体可使用本领域已知的各种各样的技术，包括使用动物免疫、杂交瘤、重组和噬 菌体展示技术或其组合来制备。可与本发明相关使用的抗体还可从供应商商购获得。
[0023] 本发明所用的抗体可以是被标记的抗体。如本文所用的术语"被标记"是指将抗体 偶联于可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、 生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射型断层摄影术的正电子发射金属、以及非 放射性顺磁性金属离子。可检测物质可直接地或通过中间体(例如本领域中已知的接头)使 用本领域中已知的技术间接地偶联或缀合于抗体(或其片段）。酶标记的实例包括萤光素酶 (例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶;美国专利No. 4，737，456 )、萤光素