加终止溶液50yL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽 量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。 [0063] (9)在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔 的光密度(O.D.值）。
[0064] 4.非小细胞肺癌组与健康对照组血浆中PRL水平
[0065]实验共231例检测对象，按表1进行分组。对建模组、验证组及所有标本集合组中 各个标本，用ELISA法检测血浆催乳素 PRL的水平，采用中位数土四分位距(median±IQR; IQR, interquartile range)的方法对血楽PRL水平进行比较。
[0066] 5.受试者的性别和年龄与PRL的相关性分析
[0067] 通过ELISA法检测血浆催乳素 PRL的水平，采用中位数土四分位距(median ± IQR; IQR, interquartile range)的统计学方法，我们对非小细胞肺癌组（116例）与健康对照组 (115例)分别进行了性别和年龄与PRL水平的相关性分析。
[0068] 6.不同组别中癌症病人与正常人的PRL，CEA，CYFRA21-1水平比较
[0069] 分别用ELISA法检测建模组与验证组中癌症病人与正常人的PRL，CEA，CYFRA21-1 水平，并对结果进行统计学分析。
[0070] 7.建模组、验证组及标本集合组对PRL，CEA，CYFRA21-1及三者联合的诊断效能分 析
[0071] 分别用ELISA法检测建模组、验证组及标本集合组中癌症病人与正常人的PRL， CEA，CYFRA21-1及三者联合水平，并对结果进行了敏感性，特异性及曲线下面积(AUC，Area Under roc Curve)分析，从而确定相关标志物的诊断效果。
[0072]四.结果与分析
[0073] 1.非小细胞肺癌组与健康对照组血浆中PRL水平的比较
[0074]在建模阶段的训练集中，非小细胞肺癌患者的血浆PRL( 12.99± 17.88ng/ml)高于 健康者（4.38± 11.89ng/ml ;P〈0 · 0001，Mann_Whitney U test)。于是我们进一步用验证组 样本进行测试，而在验证集中，非小细胞肺癌患者的血浆PRL(11.54±11.76ng/ml)也高于 健康者（7 · 35 ± 13 · 34ng/ml ;P〈0 · 0001，Mann-Whitney U test)。将两组合并后即所有标本 集合也是相似的结果（12 · 37 ± 15 · 86ng/ml>5 · 33 ± 11 · 98ng/ml ;P〈0 · 0001，Mann-Whitney U test)(见图1)。结果表明，PRL在非小细胞肺癌的诊断中有潜在的价值。根据线性回归的方 法可计算出血衆PRL的检测阈值，为约20.0 Ong/ml。本领域技术人员能够理解，在不同的患 者群体中，这个阈值可能还会有变化。一般而言，我们发现肺癌病人是健康人群的2倍左右。 [0075] 2.受试者的性别和年龄与PRL的相关性分析
[0076]疾病组（116例）和健康组（115例）分别进行了性别和年龄与PRL水平的相关性分 析。在疾病组中，年龄大于64岁患者的血浆PRL水平（14.50±17.13ng/ml)高于年龄小于等 于64岁（10.11±15.04即/1111;? = 0.047，]\^1111-￥11；[1：1167 1]七68 1:);男性患者的血楽？1^水平 为12.91±15.73即/1111，女性为10.13±18.731^/1111，差异没有统计学意义(？ = 0.609，]\&11111-Whitney U test)。在健康对照组中，性别和年龄与血浆PRL水平均无明显相关性。
[0077] 3.建模组与验证组中癌症病人与正常人的PRL，CEA，CYFRA21-1水平比较
[0078]通过图1结果表明PRL在非小细胞肺癌的诊断中有潜在的价值。为了验证这一推 测，我们用建模组及验证组样本分别测试了癌症病人与正常人的PRL，CEA，CYFRA21-1水平， 如表2，结果发现PRL，CEA，CYFRA21-1水平在两个组癌症病人中均较正常人升高，但PRL水平 变化均为最明显，这进一步确认了 PRL水平在肺癌诊断中的重要作用。
[0079] 表2.建模组与验证组中癌症病人与正常人的PRL，CEA，CYFRA21-1水平比较
[0080]
[00811 4.建模组、验证组及标本集合组对PRL，CEA，CYFRA21 -1及三者联合的诊断效能分 析
[0082]为了进一步确定PRL的诊断价值，我们对建模组、验证组及标本集合组PRL，CEA， CYFRA21-1及三者联合水平进行了进一步分析，结果见表3-4及图2。表3中，三个组别的检测 均显示PRL，CEA，CYFRA21 -1单独进行检测时，PRL检测的敏感性、特异性及准确性(AUC)较 CEA，CYFRA21-1效果好，将三者联合检测时敏感性、特异性及准确性(AUC)效果更好。表4中， 发现只有PRL对肺癌的早期诊断有效，CEA和CYFRA21-1几乎无效。图2表明，标本集合组中 CYFRA21-1，CEA，PRL及三者联合检测的准确度依次升高。所有结果均表明，PRL可以作为肺 癌诊断特别是早期诊断的侯选标志物，而且当PRL与CEA，CYFRA21-1进行联合诊断时，效果 更加理想。
[0083]表3.疾病组和对照组的相关诊断效能指标 [0084]
[0085] 注:SN敏感度;SP特异度;PPV阳性预测值;NPV阴性预测值;AUC ROC曲线下面积(相 当于总的检测准确率）
[0086] 表4.早期肺癌和对照组的相关诊断效能指标(早期为第1，2期的病人）
[0087]
[0088] 注:SN敏感度;SP特异度;PPV阳性预测值;NPV阴性预测值;AUC R0C曲线下面积(相 当于总的检测准确率）。
【主权项】
1. 一种肺癌诊断特别是早期诊断的试剂盒，其包含用于检测受试者的催乳素的水平， 特别是血浆中的催乳素水平的试剂。2. -种肺癌诊断特别是早期诊断的试剂盒，其包含用于检测受试者的催乳素、癌胚抗 原和细胞角蛋白19的水平，特别是这三者的血浆水平的试剂。3. 权利要求1或2的试剂盒，其中所述受试者是中国人群。4. 权利要求1或2的试剂盒，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。5. 权利要求域2的试剂盒，其中所述试剂是抗体，优选是被标记的抗体，例如生物素化 的抗体。6. 权利要求1-5的试剂盒，其中所述试剂盒还包含检测催乳素的水平或催乳素、癌胚抗 原和细胞角蛋白19的水平所需的其它试剂。7. 权利要求6的试剂盒，其中所述其它试剂包括ELISA试剂。8. 权利要求7的试剂盒，其中所述ELI SA试剂包括辣根过氧化物酶HPR标记的亲和素、催 乳素原核表达重组蛋白和/或癌胚抗原及细胞角蛋白19原核表达重组蛋白、0.05M PH9.6碳 酸盐缓冲液、含〇.〇5%Tween-20的0.3M PH7.4磷酸盐缓冲液、TMB溶液和2M硫酸。9. 一种用于诊断特别是早期诊断肺癌的方法，其包括检测受试者的催乳素的水平特别 是血浆中催乳素水平。10. -种用于诊断特别是早期诊断肺癌的方法，其包括检测受试者的催乳素、癌胚抗原 和细胞角蛋白19的水平特别是这三者的血浆水平。11. 权利要求9或10的方法，其中所述受试者是中国人群。12. 权利要求9或10的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。13. 权利要求9或10的方法，其包括使用抗体，优选被标记的抗体，例如生物素化的抗 体，来进行所述检测。14. 检测催乳素水平的试剂在制备用于诊断特别是早期诊断肺癌的试剂盒中的用途。15. 检测催乳素、癌胚抗原和细胞角蛋白19的水平的试剂在制备用于诊断特别是早期 诊断肺癌的试剂盒中的用途。16. 权利要求14或15的用途，其中所述试剂是抗体，优选被标记的抗体，例如生物素化 的抗体。17. 权利要求1或2的试剂盒或权利要求9或10的方法，其中所检测的血浆催乳素水平为 至少正常水平的约2倍，例如为约20.00ng/ml。
【专利摘要】本发明涉及用于诊断肺癌的方法和试剂盒，其包括检测受试者的催乳素水平特别是血浆催乳素水平，以鉴定所述受试者是否患有肺癌或处于患有肺癌的风险中。本发明还涉及检测受试者血浆中癌胚抗原和细胞角蛋白19的水平，以与所述受试者血浆中催乳素的水平联合用于诊断肺癌。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105510586
【申请号】CN201510971046
【发明人】邓友平
【申请人】湖北鹊景生物医学有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日