巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒(human Cytomegalovirus, HCMV)又称细胞包涵体病毒，属于疱疹 病毒β亚科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。本病毒对宿主或培养细胞有高度的种特 异性，人巨细胞病毒只能感染人、及在人纤维细胞中增殖，是婴儿宫内、产道和母乳感染，以 及因免疫抑制剂、器官和骨髓移植、艾滋病等所致免疫低下患者罹患严重感染的重要病原。
[0003] 巨细胞病毒是新生儿先天性致畸的重要病原微生物之一，它对胎儿的危害比风疹 病毒要大，最易引起胎儿、新生儿、婴儿的急性、慢性感染及迟发后遗症。孕妇的原发或新的 复发感染均可引起新生儿宫内或围产期感染，当孕妇患有巨细胞活动感染时，病毒可通过 胎盘进入胎儿体内引起先天性感染。孕妇的原发感染对胎儿的危害比复发感染严重，它不 仅可引起先天性感染，而且后遗症较多且严重，原发性孕期感染CMV的胎儿80%可出现智力 低下，视力受损，听力丧失等症状，特别是引起婴儿的巨细胞包涵体病(CI)，患儿可多个系 统、多个器官受损，其病死率达10%~20 % (CI的特点是网状内皮系统和中枢神经系统受 侵）。我国孕期妇女原发感染CMV的比例为3%~4%，而原发感染导致胎儿受到影响的机率为 50%，IgG亲和力检测可以帮助区分是否为原发感染或新的复发感染，因为低亲和力的IgG 抗体出现在感然后的前几个月，随着时间的推移，抗体逐渐成熟为高亲和力的抗体，高亲和 力的IgG抗体可以排除发生在4个月以内的感染，这对于在怀孕的前3个月检测出IgM抗体阳 性的孕妇，可以看出感染是否发生在怀孕前。
[0004] 目前，巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测有中和抗体法和变性剂法。中和抗体法是利 用抗原溶液将样本中的高亲和力抗体中和掉，剩余的是低亲和力抗体，亲和力指数=1-中和 结果/未中和结果，根据亲和力指数判定结果。中和抗体法的亲和力指数受到加入的中和抗 原量和样本中抗体浓度的影响，为得到准确的结果需将抗体浓度稀释到一定的范围内进行 检测，这种方法适合于全自动检测系统，对于手工操作则显得比较麻烦，且该检测产品属国 外进口产品，价格昂贵。变性剂法是利用尿素或二乙胺等变性剂处理结合在固相载体上的 抗体，低亲和力的抗体很容易被洗脱掉，高亲和力的抗体仍旧结合在固相载体上。亲和力指 数=变性处理的结果/未变性处理的结果，根据亲和力指数判定结果。变性法比较简单，但对 于全自动检测系统来说，高浓度的变性剂容易造成交叉污染，故比较适合于手工操作，但截 至目前，尚没有基于ELISA平台变性剂法检测巨细胞病毒IgG抗体亲和力的试剂盒批准上 市。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种适合手工操作且操作简便的巨细胞病毒IgG抗体亲和 力检测试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作液、 样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品;所述微孔板上包 被有巨细胞病毒抗原;所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG 抗体;所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mo 1 /L尿素配制而成。
[0007 ]所述试剂盒中还包括底物液、显色液和终止液。
[0008] 所述微孔板上包被的巨细胞病毒抗原为巨细胞基因重组抗原PP150(UL32)和gp52 (UL44)按质量比1:1的比例用pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1~0.4ug/人份后再包 被到空白微孔板上，达到最佳的包被效果，。
[0009] 所述酶结合物工作液中的抗体按体积比1:1000~10000的比例，用含牛血清、防腐 剂P300和表面活性剂Tween-20的pH7.4的Tris-Hcl缓冲液进行稀释，以兼顾灵敏度和特异 性，使试剂盒达到最佳水平。
[0010] 所述高亲和力质控品中CMV IgG高亲和力抗体按体积比1:100~500的比例，用 pH7.4 0.02M PBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。选择最佳稀释比例，以满足试剂盒的性能 要求。
[0 011 ] 所述低亲和力质控品中C Μ V I g G低亲和力抗体按体积比1: 5 5 0~10 0的比例，用 pH7.4 0.02M PBS并含有BSA的缓冲液进行稀释。选择最佳稀释比例，以满足试剂盒的性能 要求。
[0012] 所述对照缓冲液是含牛血清、防腐剂P300和表面活性剂Tween-20的PH7.4的Tris-Hcl缓冲液；所述样品稀释液是含Casein、防腐剂P300、表面活性剂Tween-20的pH7.4的 Tris-Hcl缓冲液。
[0013] 所述显色剂是含有TMB-HC1的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，PH3.0;底物液是含有过氧化 氢尿素的柠檬酸-乙酸盐缓冲液，PH5.0;所述终止液为0.4M硫酸溶液。
[0014] 本发明采用酶联免疫间接法原理进行检测，用巨细胞病毒抗原包被微孔板，辣根 过氧化物酶标记的鼠抗人IgG作为酶结合物工作液。向微孔板中加入待测样本(每个样本均 做复孔），温育反应后特异性CMV IgG抗体被结合在微孔板上，充分洗涤去掉未结合物，向其 中一孔加入解离缓冲液，另外一孔加入对照缓冲液，温育反应后低亲和力CMV IgG抗体在解 离缓冲液作用下与抗原分离。本发明试剂盒可以帮助区分巨细胞病毒感染是否为原发感染 或新的复发感染，弥补了我国对人血清或血浆中巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测的空白，适 合于手工操作，且操作方法简便，可用于大量样本的检测，为临床医生评估胎儿的健康状况 和采取进一步的措施提供有力的帮助。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过【具体实施方式】对本发明做更加详细的阐述。
[0016]本发明所述的巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒，包括微孔板、酶结合物工作 液、样品稀释液、解离缓冲液、对照缓冲液、高亲和力质控品、低亲和力质控品；所述微孔板 上包被有巨细胞病毒抗原;所述酶结合物工作液中的抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人 I gG抗体;所述解离缓冲液由PBST溶液中加入8Mo 1 /L尿素配制而成。
[0017] -、本发明试剂盒的制备 1、制备微孔板 根据文献资料及软件分析，设计引物将目的基因 gP52的优势抗原表位扩增至PET-28a 表达载体中，转化至大肠杆菌BL(DE3)进行IPTG诱导表达，大量收获菌体后进行超声破碎处 理，离心取上清进行镍柱亲和纯化，得到对应的抗原蛋白样品。通过引物设计将目的基因 PP150的优势抗原表位扩增至PET-30a表达载体中，转化至大肠杆菌BL(DE3)进行IPTG诱导 表达，大量收获菌体后进行超声破碎处理，离心取上清进行镍柱亲和纯化，得到对应的抗原 蛋白样品。
[0018] 将得到的巨细胞基因重组抗原PP150OJL32)和gp52(UL44)按质量比1:1的比例用 pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液稀释至0.1~0.4ug/人份，作为微孔板的包被液，每孔各加入 100u 1，在2~8°C条件放置16~32小时，洗板一次，加入封闭液120μ 1/孔，封闭液为PH7.4、 0.02Μ的PBS缓冲液中加入10%蔗糖和l%Casein(酪蛋白），在2~8°C放置12~24小时，达到 最佳的保护抗原蛋白稳定的效果，甩去封闭液，置于恒温干燥间干燥16~36小时。
[0019] 2、制备酶结合物工作液 在pH7.4的Tris-Hcl缓冲液中，添加20%牛血清、0.1%防腐剂P300和0.1%表面活性剂 Tween-20，配制成稀释液； 用上述配制的稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体，其中抗体与稀释液 的体积比为1:1000~10000,本实施例中选用的比例为1:4000; 3、 制备尚未和力质控品 采用PH7.4的0.02M PBS缓冲液中加入5%BSA配制成稀释液； 然后用上述配制的稀